發(fā)布時(shí)間：2020-11-11 08:17

　　 【目的】⑴驗(yàn)證POU5F1(POU domain,class 5,transcription factor 1)、SOX2[SRY(sex determining region Y)-box 2]、KLF4[Kruppel-like factor 4(gut)]和MYC(myelocytomatosis oncogene)基因在綿羊睪丸組織中的表達(dá)方式并克隆表達(dá)的m RNA序列。構(gòu)建攜帶綿羊重編程因子基因序列的逆轉(zhuǎn)錄病毒基因傳遞表達(dá)載體,為將來獲得綿羊Leydig細(xì)胞源誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cell,i PSC)系提供物質(zhì)基礎(chǔ)。⑵用HSD3B染色方法確定成年小鼠Leydig細(xì)胞的體外生長(zhǎng)形態(tài)特征,為更好地鑒別體外培養(yǎng)的綿羊Leydig細(xì)胞提供技術(shù)基礎(chǔ)。【方法】⑴互補(bǔ)DNA模板來源于1周齡和6月齡大的湖羊的睪丸組織,通過RT-PCR和測(cè)序分別驗(yàn)證了POU5F1、SOX2、KLF4和MYC基因在綿羊睪丸中的表達(dá)方式以及分別對(duì)表達(dá)的m RNA進(jìn)行分子克隆。⑵基因組模板來自培養(yǎng)的30-40妊娠日齡的蒙古綿羊的胎兒成纖維細(xì)胞,通過PCR和測(cè)序驗(yàn)證綿羊KLF4的基因組序列。⑷構(gòu)建4個(gè)攜帶綿羊重編程因子基因序列的逆轉(zhuǎn)錄病毒基因傳遞表達(dá)載體,分別為p MXs-o POU5F1、p MXs-o SOX2、p MXs-o KLF4和p MXs-o MYC質(zhì)粒。用限制性內(nèi)切酶酶切法和測(cè)序法驗(yàn)證構(gòu)建質(zhì)粒序列的正確性。⑸將參照組的p MXs-GFP質(zhì)粒和構(gòu)建的4個(gè)質(zhì)粒運(yùn)用磷酸鈣轉(zhuǎn)染法分別轉(zhuǎn)染入Phoenix Amphotropic細(xì)胞系。轉(zhuǎn)染48 h和72 h后,在熒光條件下觀察p MXs-GFP的轉(zhuǎn)染效果,并對(duì)培養(yǎng)的新生綿羊的Leydig細(xì)胞進(jìn)行感染。細(xì)胞感染4 d后,在熒光條件下觀察p MXs-GFP質(zhì)粒對(duì)綿羊Leydig細(xì)胞的感染效果,并用RT-PCR法驗(yàn)證這4個(gè)質(zhì)粒攜帶基因的外源表達(dá)情況。⑹2月齡大的小鼠睪丸,剝離白膜后,用膠原酶消化獲得Leydig細(xì)胞。Leydig細(xì)胞通過HSD3B染色方法鑒定�！窘Y(jié)果】⑴POU5F1在新生的和性成熟的湖羊睪丸中均表達(dá)。綿羊POU5F1的m RNA包含了一個(gè)1080 bp的開放閱讀框(open reading frame,ORF),編碼了359個(gè)氨基酸。綿羊POU5F1含有1個(gè)POU結(jié)構(gòu)域和1個(gè)homeobox結(jié)構(gòu)域。綿羊POU5F1蛋白第206位的賴氨酸和第207位的纈氨酸的序列是物種特異的,其它的哺乳動(dòng)物在此對(duì)應(yīng)的賴氨酸和纈氨酸位點(diǎn)之間還有一個(gè)色氨酸。⑵SOX2在新生的和性成熟的湖羊睪丸中均表達(dá)。綿羊SOX2的m RNA含有一個(gè)963 bp的ORF,編碼了320個(gè)氨基酸。綿羊SOX2含有1個(gè)HMG(high mobility group)結(jié)構(gòu)域。⑶MYC在新生的綿羊睪丸中表達(dá)。綿羊MYC的m RNA包含了一個(gè)1320 bp的ORF,編碼了439個(gè)氨基酸。綿羊MYC含有1個(gè)HLH(helix-loop-helix)結(jié)構(gòu)域。⑷綿羊KLF4基因組從起始密碼子到終止密碼子的序列長(zhǎng)度為3159bp,含有一個(gè)1434 bp的ORF,編碼了477個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。綿羊KLF4基因含有4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子。綿羊KLF4蛋白在肽鏈的碳端有3個(gè)C2H2(cysteine2/histidine2)型的鋅指。POU5F1、SOX2、KLF4和MYC氨基酸序列分析表明綿羊與牛有著最近的進(jìn)化關(guān)系,與靈長(zhǎng)類和嚙齒類有著相對(duì)較遠(yuǎn)的進(jìn)化關(guān)系。SOX2和KLF4蛋白的氨基酸序列在綿羊和牛中是100%的一致。⑸限制性內(nèi)切酶酶切法和測(cè)序法驗(yàn)證了構(gòu)建的p MXs-o POU5F1、p MXs-o SOX2、p MXs-o KLF4和p MXs-o MYC質(zhì)粒序列的正確性。通過用p MXs-GFP質(zhì)粒做對(duì)照,預(yù)測(cè)這4個(gè)構(gòu)建的質(zhì)粒能夠在AMPHO細(xì)胞系中有效地轉(zhuǎn)染。RT-PCR結(jié)果表明,這4個(gè)逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒攜帶的外源基因均能夠在綿羊Leydig細(xì)胞基因組中整合并轉(zhuǎn)錄。⑹HSD3B染色鑒定后表明,培養(yǎng)48 h的成年小鼠Leydig細(xì)胞,在光學(xué)顯微鏡下能夠清晰地分辨出Leydig細(xì)胞的細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)。Leydig細(xì)胞的細(xì)胞核大而圓;細(xì)胞質(zhì)布滿了致密的脂滴,細(xì)胞質(zhì)折光性強(qiáng)。Leydig細(xì)胞培養(yǎng)5 d后,細(xì)胞充分伸展,形態(tài)多樣。一些細(xì)胞聚集生長(zhǎng),一些細(xì)胞單獨(dú)生長(zhǎng)。聚集生長(zhǎng)的各個(gè)細(xì)胞通過細(xì)胞的觸角(cellular tentacles)相互聯(lián)系,形成了表皮樣的外貌。RT-PCR結(jié)果顯示,體外培養(yǎng)5 d的Leydig細(xì)胞能夠表達(dá)Leydig細(xì)胞特異的轉(zhuǎn)錄,包括HSD3B6、CYP17A1和St AR�！窘Y(jié)論】新生湖羊的睪丸組織能夠表達(dá)POU5F1、SOX2和MYC基因,但不表達(dá)KLF4基因。獲得了綿羊POU5F1、SOX2和MYC基因的編碼區(qū)的m RNA序列,以及獲得了蒙古綿羊KLF4的基因組序列。構(gòu)建了有效的攜帶綿羊重編程因子基因序列的逆轉(zhuǎn)錄病毒基因傳遞表達(dá)載體,分別為p MXs-o POU5F1、p MXs-o SOX2、p MXs-o KLF4和p MXs-o MYC。鑒定了體外培養(yǎng)的成年小鼠Leydig細(xì)胞的生長(zhǎng)形態(tài)特征,為將來更好地鑒定體外培養(yǎng)的綿羊Leydig細(xì)胞提供技術(shù)基礎(chǔ)。這些研究結(jié)果可為將來獲得綿羊Leydig細(xì)胞源i PSCs打下基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2016
【中圖分類】：S826
【部分圖文】：

中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文 第二章的曲細(xì)精管中只有一層精原干細(xì)胞1 周齡的綿羊睪丸中容易分辨2-1C， 1）。6 月齡的綿羊睪丸的曲細(xì)精管中有多層的生殖系細(xì)胞精子（圖 2-1D，5），Sertoli周齡的曲細(xì)精管的形狀不規(guī)則的形狀趨于卵圓形，曲細(xì)精管的內(nèi)腔增大細(xì)胞與 Leydig 細(xì)胞之間較疏松之間 （圖 2-1C，2）；而 6細(xì)胞多以細(xì)胞團(tuán)的形式分布于曲細(xì)精管之間綿羊 POU5F1、SOX2、KLF4 和 MYC 基因的分子克隆、序列特征及其在睪丸組織中的表達(dá)分析的曲細(xì)精管中只有一層精原干細(xì)胞，分布在曲細(xì)精管的基膜上（圖 2-1C，周齡的綿羊睪丸中容易分辨，Sertoli 形狀不規(guī)則，細(xì)胞體積一般大于精原干細(xì)胞的體積月齡的綿羊睪丸的曲細(xì)精管中有多層的生殖系細(xì)胞（圖 2-1細(xì)胞不易分清。通過對(duì)比 1 周齡和 6 月齡的睪丸組織周齡的曲細(xì)精管的形狀不規(guī)則，曲細(xì)精管的內(nèi)腔小（圖 2-1A 和圖 2-1C）；曲細(xì)精管的內(nèi)腔增大（圖 2-1B 和圖 2-1D）。1 周齡的綿羊睪丸的細(xì)胞之間較疏松，Leydig 細(xì)胞團(tuán)或單個(gè)的 Leydig 細(xì)胞不規(guī)律地分布于曲細(xì)精管月齡的綿羊睪丸的 Leydig 細(xì)胞與 Leydig 細(xì)胞之間較緊密細(xì)胞多以細(xì)胞團(tuán)的形式分布于曲細(xì)精管之間（圖 2-1B，2）。序列特征及其在睪丸組織中的表達(dá)分析1）。Sertoli 細(xì)胞在細(xì)胞體積一般大于精原干細(xì)胞的體積（圖1B，4），已能產(chǎn)生出月齡的睪丸組織，可以看出 16 周齡的曲細(xì)精管Leydig細(xì)胞之間較緊密，Leydig

sequence is shown below the nucleotide sequence. Termination codon is indicated with asterisks (*). Amino acid residues(serine, threonine and tyrosine) in a black background are the predicted phosphorylation sites.圖2-6 綿羊POU5F1的開放閱讀框和假定的編碼的氨基酸序列Figure 2-6 Open reading frame and deduced amino acid sequence of sheep POU5F1.

sequence is shown below the nucleotide sequence. Termination codon is indicated with asterisks (*). Amino acid residues(serine, threonine) in a black background are the predicted phosphorylation sites.圖2-8 綿羊MYC的開放閱讀框和假定的編碼的氨基酸序列Figure 2-8 Open reading frame and deduced amino acid sequence of sheep MYC.

本文編號(hào)：2878961