發(fā)布時間：2020-11-11 23:30

　　 仔豬腹瀉是一種以新生和幼齡仔豬為主的腸道傳染性疾病,在養(yǎng)豬生產(chǎn)中普遍存在,嚴(yán)重影響了養(yǎng)豬業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益。C型產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens type C,C.perfringens type C)是引起仔豬腹瀉的主要病原菌之一。盡管通過提高飼養(yǎng)管理水平、接種疫苗和藥物防治等措施在一定程度上減少了仔豬腹瀉的發(fā)生,但由于仔豬的耐藥性使得對腹瀉防治的難度不斷加大。因此,從長遠(yuǎn)來看,采用遺傳學(xué)方法從遺傳本質(zhì)上提高仔豬對腹瀉的抗性,是減少仔豬腹瀉發(fā)生的重要手段。研究發(fā)現(xiàn),miRNA在調(diào)控大腸桿菌和沙門氏菌感染引起仔豬腹瀉的過程中發(fā)揮著重要作用,而且諸多研究已證實小腸在仔豬抵抗病原菌感染過程中有重要調(diào)控功能,但回腸中miRNA如何參與調(diào)控C型產(chǎn)氣莢膜梭菌引起仔豬腹瀉的功能尚不清楚。鑒于此,本研究選取30頭7日齡健康仔豬(長×大),隨機(jī)選取5頭仔豬作為對照組(IC),其余25頭仔豬進(jìn)行C型產(chǎn)氣莢膜梭菌口服攻毒試驗,根據(jù)腹瀉總評分篩選出易感組(IS)和耐受組(IR)仔豬,采用高通量測序技術(shù)對IC、IS和IR仔豬的回腸組織進(jìn)行Small RNA測序,獲取差異表達(dá)miRNA,預(yù)測差異表達(dá)miRNA靶基因,并進(jìn)行GO功能和KEGG信號通路富集分析,篩選與仔豬C型產(chǎn)氣莢膜梭菌性腹瀉抗性相關(guān)的miRNA,在IPEC-J2細(xì)胞上研究其生物學(xué)功能。主要的研究結(jié)果:(1)共獲得617個miRNA(319個已知miRNA和298個新miRNA),對其表達(dá)量進(jìn)行了顯著性統(tǒng)計分析,共有53個差異表達(dá)miRNA。IS vs IC、IR vs IS和IR vs IC三個比較組分別有40個(20上調(diào)和20個下調(diào))、10個(4上調(diào)和6個下調(diào))和19個(9個上調(diào)和10個下調(diào))差異表達(dá)miRNA。(2)GO功能富集分析發(fā)現(xiàn),差異表達(dá)miRNA的靶基因主要富集在炎癥反應(yīng)的調(diào)控(Regulation of inflammatory response)、免疫系統(tǒng)過程(Immune system process)、白細(xì)胞介素-6產(chǎn)生的調(diào)控(Regulation of interleukin-6 production)、MAPK活性的激活參與先天免疫反應(yīng)(Activation of MAPK activity involved in innate immune response)等一些與免疫、炎癥反應(yīng)相關(guān)的GO功能。(3)KEGG信號通路分析發(fā)現(xiàn),這些靶基因主要富集在一些與感染性疾病、免疫相關(guān)的信號通路,如MAPK信號通路(MAPK signaling pathway)、ErbB信號通路(ErbB signaling pathway)、Jak-STAT信號通路(Jak-STAT signaling pathway)、Wnt信號通路(Wnt signaling pathway)、ECM受體的交互作用(ECM-receptor interaction)等。(4)篩選出了1個與C型產(chǎn)氣莢膜梭菌性腹瀉抗性相關(guān)的關(guān)鍵miRNA,即miR-500,RT-qPCR結(jié)果顯示其靶基因HSPA2表達(dá)量IS和IR組顯著高于IC組(P0.05),且IS組顯著高于IR組(P0.05);靶基因TDP2表達(dá)量IR組顯著高于IC組(P0.05),IS組極顯著高于IC組(P0.01),且IS組顯著高于IR組(P0.05)。(5)成功構(gòu)建了靶基因HSPA2和TDP2的野生型和突變型雙熒光素酶載體(psi-CHECK~(TM)-2-HSPA2-3'UTR WT、psi-CHECK~(TM)-2-HSPA2-3'UTR Mut、psi-CHECK~(TM)-2-TDP2-3'UTR WT、psi-CHECK~(TM)-2-TDP2-3'UTR Mut)。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果顯示:靶基因HSPA2和TDP2的野生型載體+mimics組熒光素酶活性極顯著低于野生型載體+mimics NC組(P0.01),突變型載體+mimics組與突變型載體+mimics NC熒光素酶活性差異不顯著(P0.05);mimics+psi-CHECK~(TM)-2組與mimics NC+psi-CHECK~(TM)-2組熒光素酶活性差異不顯著(P0.05)。(6)RT-qPCR結(jié)果顯發(fā)現(xiàn),miR-500 mimics轉(zhuǎn)染組HSPA2和TDP2基因的表達(dá)量極顯著低于mimics NC轉(zhuǎn)染組(P0.01),miR-500 inhibitor轉(zhuǎn)染組HSPA2和TDP2基因的表達(dá)量極顯著高于inhibitor NC轉(zhuǎn)染組(P0.01)。WB結(jié)果發(fā)現(xiàn),靶基因TDP2的蛋白表達(dá)量在miR-500 mimics轉(zhuǎn)染組極顯著低于mimics NC(P0.01),miR-500 inhibitor轉(zhuǎn)染組極顯著高于inhibitor NC(P0.01);HSPA2蛋白表達(dá)量在miR-500 mimics轉(zhuǎn)染組極顯著低于mimics NC(P0.01),而miR-500 inhibitor轉(zhuǎn)染組顯著低于inhibitor NC(0.05P0.01)。(7)MTT、CCK8和EDU法檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn),miR-500 mimics轉(zhuǎn)染組細(xì)胞活力均極顯著高于mimics NC轉(zhuǎn)染組(P0.01),miR-500 inhibitor轉(zhuǎn)染組細(xì)胞活力均極顯著低于inhibitor NC轉(zhuǎn)染組(P0.01)。(8)Beta2毒素侵染IPEC-J2細(xì)胞后,miR-500的表達(dá)量極顯著降低(P0.01),LDH活性極顯著增強(qiáng)(P0.01),miR-500 mimics轉(zhuǎn)染組LDH活性極顯著低于mimics NC轉(zhuǎn)染組(P0.01),miR-500 inhibitor轉(zhuǎn)染組LDH活性極顯著高于inhibitor NC轉(zhuǎn)染組(P0.01);炎性細(xì)胞因子IL-6、IL-7、IL-8和TNF-α的表達(dá)量均為miR-500 mimics轉(zhuǎn)染組極顯著低于mimics NC組(P0.01),miR-500inhibitor轉(zhuǎn)染組極顯著高于inhibitor NC組(P0.01);而IL-10的表達(dá)量miR-500mimics轉(zhuǎn)染組極顯著高于mimics NC組(P0.01),miR-500 inhibitor轉(zhuǎn)染組極顯著低于inhibitor NC組(P0.01)。綜上所述,我們挖掘出了1個與C型產(chǎn)氣莢膜梭菌性腹瀉抗性相關(guān)的關(guān)鍵miRNA,即miR-500;miR-500可靶向調(diào)控HSPA2和TDP2基因的mRNA和蛋白的表達(dá),促進(jìn)IPEC-J2細(xì)胞的增殖,并且可減弱Beta2毒素對IPEC-J2細(xì)胞的毒性,抑制促炎細(xì)胞因子和誘導(dǎo)抗炎細(xì)胞因子的釋放。miR-500在仔豬感染C型產(chǎn)氣莢膜梭菌引起的腹瀉過程中起著重要的調(diào)控作用,研究結(jié)果可為腹瀉抗性豬品系的培育提供參考。
【學(xué)位單位】：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2020
【中圖分類】：S858.28
【部分圖文】：

首先將目的片段連接到pMDTM19-T載體(圖3-1)上,然后將連接成功的pMDTM19-T載體和psi-CHECKTM-2空載體(圖3-2)分別用Xho I和Not I快切酶進(jìn)行雙酶切,用T4 DNA連接酶連接在一起,然后轉(zhuǎn)化、涂板、挑菌、菌液PCR、測序(蘇州金唯智生物科技有限公司)、提取質(zhì)(無內(nèi)毒素質(zhì)粒小提中量試劑盒),獲得HSPA2和TDP2基因野生型載體psi-CHECKTM-2-HSPA2-3"UTR WT和psi-CHECKTM-2-TDP2-3"UTR WT,保存于-20℃?zhèn)溆�。具體試驗步驟如下:圖3-2 psi-CHECKTM-2載體圖譜

圖3-1 pMDTM19-T載體圖譜(1)PCR擴(kuò)增:以豬小腸上皮細(xì)胞系(IPEC-J2)的c DNA為模板,PCR擴(kuò)增靶基因HSPA2和TDP2的3’UTR區(qū)含有miR-500結(jié)合位點的部分DNA寡聚核苷酸序列(該序列含有Xho I和Not I酶切位點),引物序列見表3-2,由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。反應(yīng)體系為20μL:2×Taq PCR Master Mix 10μL,上下游引物各1.0μL,cDNA模板2ul,ddH2O補(bǔ)至20μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序為:95℃預(yù)變性5min,94℃變性30s,60℃退火30s,72℃延伸60s,共31個循環(huán);72℃延伸10min,4℃保存。取5μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

本研究成功構(gòu)建了靶基因HSPA2和TDP2及突變結(jié)合位點后的雙熒光素酶載體,并成功獲得了各自對應(yīng)的野生型和突變型載體質(zhì)粒。圖3-3為miR-500與其靶基因HSPA2和TDP2(及突變后的HSPA2和TDP2 Mut)結(jié)合位點的結(jié)合示意圖。擴(kuò)增HSPA2和TDP2 3’UTR區(qū)部分核苷酸序列(圖3-4 A),并成功構(gòu)建其雙熒光素酶載體,酶切鑒定如圖3-4 B。經(jīng)過測序驗證獲得HSPA2和TDP2部分3’UTR區(qū)雙熒光素酶載體psi-CHECKTM-2-HSPA2-3"UTR WT、psi-CHECKTM-2-TDP2-3"UTR WT及其突變載體psi-CHECKTM-2-HSPA2-3"UTR Mut、psi-CHECKTM-2-TDP2-3"UTR Mut質(zhì)粒,測序峰圖見圖3-5。圖3-4 HSPA2和TDP2基因3’UTR區(qū)部分序列的PCR擴(kuò)增圖(A)和雙熒光素酶載體酶切圖(B)
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2879907