發(fā)布時間：2018-01-05 06:38

  本文關鍵詞：體內抑制法尼基焦磷酸合成酶可以改善壓力超負荷誘導的心臟重塑　出處：《浙江大學》2017年博士論文　論文類型：學位論文

  更多相關文章： 法尼基焦磷酸合成酶 基因干擾 心臟重塑 壓力超負荷 Ras蛋白 法尼基焦磷酸合成酶 條件性基因敲除

【摘要】：第一部分體內抑制法尼基焦磷酸合成酶可以改善壓力超負荷誘導的心臟重塑研究背景:法尼基焦磷酸合成酶(FPPS)是甲羥戊酸途徑中一個重要的分支酶。作為膽固醇合成的中間步驟,FPPS催化C5單位的異戊烯焦磷酸(IPP)和其同分異構體二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)連續(xù)縮合,生成10C單位的r{牛兒基焦磷酸(GPP)和15C單位的法尼基焦磷酸(FPP)。FPP不僅是合成膽固醇和輔酶Q的重要底物,也是眾多小G蛋白法尼基化修飾的法尼基來源。已有研究表明抑制FPPS可以改善AngII誘導的心臟重塑,而壓力超負荷誘導的高血壓大鼠模型中FPPS和部分小G蛋白表達升高。我們通過基因干擾技術抑制小鼠FPPS表達,探索FPPS在壓力超負荷誘導的心臟重塑中的效應以及作用機制。目的:通過基因干擾技術抑制小鼠FPPS表達,探索FPPS在壓力超負荷誘導的心臟重塑中的效應以及作用機制。方法:(1)設計若干FPPS短發(fā)夾RNA序列,慢病毒包裝感染小鼠原代心肌細胞。用免疫蛋白印跡法驗證每一個序列的干擾效率。(2)篩選出FPPS基因干擾效率高的序列,將對應序列的慢病毒顯微注射到小鼠胚胎細胞。(3)篩選含有干擾序列的陽性轉基因小鼠,驗證小鼠心臟組織FPPS干擾效率。同時鑒定子代陽性小鼠的FPPS干擾效率,確保其干擾效率能穩(wěn)定遺傳到子代。(4)將F3代雄性FPPS干擾轉基因雄鼠和非轉基因同窩對照雄鼠隨機分為手術組和假手術組。用腹主動脈縮窄術建立壓力超負荷模型。(5)術后12周,測量小鼠的心臟功能,尾動脈血壓。(6)組織病理學分析心肌細胞大小和心肌纖維化水平。(7)免疫蛋白印跡法測量FPPS蛋白及其通路下游蛋白水平變化。(8)G-LISA法測量Ras,RhoA,Rac1和CDC42活性。(9)熒光定量PCR法測量心臟胚胎基因的表達。結果:(1)pLVT202序列可以抑制心肌細胞FPPS表達。(2)成功構建了 FPPS干擾的轉基因小鼠,其心臟組織FPPS干擾效率約為50%。其子代轉基因小鼠均能穩(wěn)定干擾FPPS表達,轉基因小鼠較同窩野生型小鼠表達量降低了 50%。(3)成功構建了腹主動脈縮窄術引起的小鼠壓力超負荷模型。術后12周,小鼠心臟明顯擴大,心肌細胞肥厚,心肌纖維化明顯。(4)術后12周時,干擾FPPS表達可以降低壓力超負荷引起的心力衰竭指標升高水平、減少心肌細胞肥厚水平和心肌纖維化水平,同時提高射血分數。(5)術后12周時,干擾FPPS可以降低壓力超負荷引起的Ras蛋白的活化和ERK1/2磷酸化升高,但并不能抑制活化RhoA水平的升高。結論:干擾FPPS表達可以部分改善壓力超負荷引起的心力衰竭、心肌細胞肥厚和心肌纖維化。其機制可能是降低Ras蛋白的活化水平,進而降低ERK1/2磷酸化水平,抑制心肌細胞增殖和纖維化。第二部分構建心肌細胞條件性法尼基焦磷酸合成酶基因敲除小鼠研究背景:法尼基焦磷酸合成酶(FPPS)是甲羥戊酸途徑中一個重要的分支酶。作為膽固醇合成的中間步驟,FPPS催化C5單位的異戊烯焦磷酸(IPP)和其同分異構體二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)連續(xù)縮合,生成10C單位的r{牛兒基焦磷酸(GPP)和15C單位的法尼基焦磷酸(FPP)。FPP不僅是合成膽固醇和輔酶Q的重要底物,也是眾多小G蛋白法尼基化修飾的法尼基來源�；�因敲除小鼠模型被認為是很好的研究基因功能的模型,而目前并沒有FPPS基因敲除小鼠模型的參考文獻。因此,為了更深入的研究FPPS基因在心臟重塑病理中的作用,我們構建心肌細胞條件性法尼基焦磷酸合成酶基因敲除小鼠模型。目的:構建心肌細胞條件性法尼基焦磷酸合成酶基因敲除小鼠模型。方法:(1)設計并構建FPPS條件性基因敲除打靶載體質粒。(2)ES細胞電穿孔轉移線性化質粒,篩選序列正確的陽性克隆,移植胚胎。(3)鑒定嵌合體小鼠,繁殖獲得FPPS-Flox純合子小鼠。(4)繁殖獲得與心肌特異性表達Cre重組酶的Myh6-MerCreMer的FPPSfl/flCre+/-小鼠。腹腔注射他莫昔芬后驗證心肌組織特異性敲除FPPS的效率。結果:(1)成功獲得了 FPPS-Flox純合子小鼠和心肌特異性表達Cre重組酶的Myh6-MerCreMer 的 FPPSfl/flCre+/-小鼠。(2)腹腔注射他莫昔芬后8周,小鼠心肌組織FPPS表達降低了約80%。結論:我們成功構建了心肌細胞條件性法尼基焦磷酸合成酶基因敲除小鼠模型。
[Abstract]:The first part of inhibition of farnesyl pyrophosphate synthase can improve the pressure overload induced cardiac remodeling of farnesyl pyrophosphate synthase (FPPS) is an important branch of the enzyme in the mevalonate pathway. As an intermediate step in cholesterol synthesis catalyzed by FPPS C5, a isopentenyl pyrophosphate (IPP) and the same isomer two methyl allyl pyrophosphate (DMAPP) continuous condensation, r{geranylgeranyl pyrophosphate 10C generation unit (GPP) of farnesyl pyrophosphate and 15C units (FPP).FPP is an important substrate for synthesis of cholesterol and coenzyme Q, is also a large number of small G protein farnesylation farnesyl source. The existing research inhibition of FPPS can improve the cardiac remodeling induced by AngII, and the pressure increased the expression of FPPS and small G protein hypertensive rat model induced by load. Through RNA interference inhibited FPPS expression, exploration The effect of cable FPPS in cardiac remodeling induced by pressure overload and the mechanism. Objective: through the technique of gene interference inhibited FPPS expression, explore the effect of FPPS on cardiac remodeling induced by pressure overload in and mechanism. Methods: (1) the design of several FPPS short hairpin RNA sequences, lentiviral infection of primary packaging mouse cardiomyocytes. Verify the interference efficiency of every sequence by Western blot method. (2) screened FPPS gene interference and high efficiency, the corresponding sequence of lentivirus were microinjected into mouse embryonic cells. (3) positive transgenic mice containing siRNA screening, verification of mouse heart tissue FPPS interference efficiency. At the same time, the efficiency of FPPS interference identification of offspring positive mice, to ensure the efficiency of interference can be stably inherited by the offspring. (4) the F3 generation of male FPPS interference transgenic male rats and non transgenic littermates of male rats were randomly divided into control Operation group and sham operation group. The surgery to establish model of pressure overload by abdominal aorta. (5) 12 weeks after surgery, cardiac function measurement in mice, the blood pressure of tail artery. (6) analysis of myocardial cell size and the level of myocardial fibrosis pathological changes (7). Western blot was used to measure FPPS protein and the pathway downstream protein level. (8) measurement of Ras, G-LISA RhoA, Rac1 and CDC42 activity. (9) gene expression in embryonic heart measured by fluorescence quantitative PCR method. Results: (1) pLVT202 sequence can inhibit the expression of myocardial FPPS. (2) the successful construction of transgenic mice by FPPS interference, the heart tissue FPPS the interference efficiency is about 50%. of the offspring of transgenic mice expressed stable knockdown of FPPS transgenic mice, compared with wild type littermates decreased expression of 50%. (3) was constructed successfully pressure abdominal aorta constriction caused by overload model. After 12 weeks, the mouse heart obviously Expansion, myocardial hypertrophy, myocardial fibrosis significantly. (4) 12 weeks after the operation, the expression of FPPS can reduce the interference index of heart failure induced by pressure overload elevated levels, reduce myocardial cell hypertrophy and myocardial fibrosis, and improve LVEF. (5) 12 weeks after the operation, the interference of FPPS can reduce the pressure overload induced Ras protein activation and phosphorylation of ERK1/2 increased, but did not inhibit the activation level of RhoA increased. Conclusion: the expression of FPPS can improve the disturbance of heart failure induced by pressure overload, myocardial cell hypertrophy and cardiac fibrosis. The mechanism may be to reduce the activation level of Ras protein, thereby reducing the phosphorylation level of ERK1/2 and the inhibition of myocardial cell proliferation and fibrosis. The second part is the construction of farnesyl pyrophosphate synthase gene knockout mice myocardial cell background: farnesyl pyrophosphate synthase (FPPS) is An important branch of the enzyme in the mevalonate pathway. As an intermediate step in cholesterol synthesis, isopentenyl pyrophosphate catalyzed by FPPS C5 units (IPP) and its isomer two methyl allyl pyrophosphate (DMAPP) continuous condensation, r{geranylgeranyl pyrophosphate 10C generation unit (GPP) of farnesyl phosphate and 15C units (FPP).FPP is an important substrate for synthesis of cholesterol and coenzyme Q, is also a large number of small G protein farnesylation farnesyl. Gene knockout mice are considered to study gene function good model, and there is no FPPS gene knockout mice model reference. Therefore in order to study the role of FPPS, further gene in cardiac remodeling pathology, we construct farnesyl pyrophosphate synthase gene knockout mouse model of myocardial cells. Objective: to construct myocardial cell conditioned farnesyl pyrophosphate synthase base For the knockout mice. Methods: (1) the design and construction of knockout vector plasmid FPPS conditional gene. (2) ES cell electroporation transfer linearized plasmid, and positive clones were screened for the correct sequence of embryos. (3) Jian Dingqian chimeric mice to produce FPPS-Flox, homozygous mice. (4) to produce recombinant Cre myocardial enzymes and specific expression of Myh6-MerCreMer in FPPSfl/flCre+/- mice. After intraperitoneal injection of tamoxifen to verify myocardial tissue specificity of FPPS knockdown efficiency. Results: (1) successfully obtained FPPS-Flox homozygous mice and FPPSfl/flCre+/- mice cardiac specific table of Cre recombinase Myh6-MerCreMer. (2) 8 weeks after intraperitoneal injection of tamoxifen, expression mouse myocardial FPPS reduced about 80%. conclusion: we successfully constructed the farnesyl pyrophosphate synthase gene knockout mouse model of myocardial cells.

【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R54

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本文編號：1382006