發(fā)布時間：2018-01-05 12:24

  本文關(guān)鍵詞：lncRNA-MEG3抑制結(jié)直腸癌發(fā)生、轉(zhuǎn)移及其機制研究　出處：《第二軍醫(yī)大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

  更多相關(guān)文章： 結(jié)直腸癌 長鏈非編碼RNA MEG3 預(yù)后 轉(zhuǎn)移

【摘要】：一、研究背景:全球每年大約有100到200萬人被診斷為結(jié)直腸癌,死于結(jié)直腸癌人數(shù)超過60萬。結(jié)直腸癌的發(fā)生是一個多階段、多步驟過程,其中多種癌基因活化和抑癌基因的失活是導(dǎo)致結(jié)直腸癌發(fā)生和發(fā)展的關(guān)鍵因素。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是參與腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移的一個重要表觀遺傳學(xué)調(diào)控因子。lncRNA-MEG3是最早被發(fā)現(xiàn)具有腫瘤抑制功能的一條lncRNA,在多種腫瘤組織和細(xì)胞中表達受到抑制。研究發(fā)現(xiàn)MEG3具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移的能力。目前已研究表明MEG3可通過促進p53表達或結(jié)合某些miRNA分子來發(fā)揮抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用。然而目前l(fā)ncRNA相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)lncRNA可以通過多種方式在不同層面上參與基因表達調(diào)控從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。MEG3在結(jié)腸癌發(fā)生作用及相關(guān)分子機制有待進一步探討。在本課題中,我們將首先從臨床組織樣本出發(fā),探討結(jié)直腸癌中MEG3與臨床病理特征的關(guān)系以及對患者預(yù)后評估的價值。并通過體內(nèi)/外實驗檢測MEG3在結(jié)直腸癌中的生物學(xué)功能。在此基礎(chǔ)上,我們對MEG3抑制結(jié)直腸癌作用的調(diào)控機制展開了深入探索,為進一步臨床轉(zhuǎn)化提供理論基礎(chǔ)。二、實驗方法:1.檢測MEG3在結(jié)直腸癌與癌旁組織中的表達:通過實時定量PCR檢測61對結(jié)直腸癌及癌旁新鮮組織中MEG3表達水平的變化;原位雜交技術(shù)檢測27對結(jié)直腸癌與癌旁石蠟切片中MEG3表達情況。通過原位雜交技術(shù)檢測結(jié)直腸癌組織芯片中MEG3的表達,并通過統(tǒng)計學(xué)分析MEG3與臨床病理特征以及患者生存預(yù)后間的關(guān)系。2.通過體內(nèi)外實驗分別檢測MEG3的表達對結(jié)直腸癌生物學(xué)特性的影響:體外實驗:采用CCK8實驗檢測MEG3對細(xì)胞增殖能力的影響;采用Transwell實驗檢測MEG3對細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響;通過流式細(xì)胞儀檢測MEG3對細(xì)胞凋亡的影響。體內(nèi)實驗:建立裸鼠結(jié)直腸癌荷瘤生長模型,考察MEG3對結(jié)直腸癌細(xì)胞體內(nèi)成瘤的影響;建立裸鼠肺轉(zhuǎn)移瘤模型,考察MEG3對結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移的影響。3.MEG3上游調(diào)控基因的檢測:通過生物信息學(xué)分析在MEG3的啟動子區(qū)域有可能結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子;通過細(xì)胞實驗和組織芯片進一步驗證MEG3與轉(zhuǎn)錄因子VDR的相關(guān)性;利用熒光素酶報告基因和染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)進一步驗證VDR和活性維生素D是否可以調(diào)控MEG3的表達。4.MEG3對結(jié)直腸癌抑制作用的機制研究:通過RNA-pulldown技術(shù)和質(zhì)譜分析篩選獲得與MEG3潛在結(jié)合的靶蛋白分子。通過Westernblot和RNA免疫共沉淀技術(shù)驗證靶蛋白CLU與MEG3的相互結(jié)合;通過emsa技術(shù)進一步驗證MEG3與靶蛋白直接結(jié)合,再將各截短MEG3片段分別與靶蛋白共孵育,通過EMSA實驗檢測靶蛋白與MEG3綁定的區(qū)域;通過CCK8,transwell實驗驗證MEG3通過下游靶蛋白影響腸癌的增殖、遷移和侵襲的功能;利用實時定量PCR和Westernblot技術(shù)檢測過表達MEG3腸癌細(xì)胞株中下游靶蛋白的表達情況。三、實驗結(jié)果:1.MEG3在結(jié)直腸癌中低表達及其與結(jié)直腸癌患者預(yù)后不良有關(guān)1.1MEG3在結(jié)直腸癌組織中的表達:通過實時定量PCR實驗和原位雜交技術(shù)檢測癌與癌旁組織中MEG3的表達水平,發(fā)現(xiàn)癌旁組織中MEG3的表達量明顯高于結(jié)直腸癌組織中的表達,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)。1.2總生存期患者MEG3的表達與結(jié)直腸癌臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系:采用Kaplan-meier分析總生存期MEG3表達高的患者生存期也明顯長于MEG3低表達患者(p=0.007)。采用cox比例回歸模型對總生存期進行單因素分析發(fā)現(xiàn)MEG3的表達、tnm分期、CEA和CA199和結(jié)直腸癌患者生存預(yù)后具有相關(guān)性(p0.05);而結(jié)直腸癌患者的性別、年齡、腫瘤的浸潤深度、腫瘤部位、腫瘤分化程度等臨床病理特征與患者生存預(yù)后無關(guān),不具有統(tǒng)計學(xué)意義。采用多因素矯正后分析,發(fā)現(xiàn)MEG3低表達、結(jié)直腸癌的TNM分期和CEA水平是影響結(jié)直腸癌患者生存預(yù)后的獨立風(fēng)險因素。1.3無瘤生存期患者MEG3的表達與結(jié)直腸癌臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系:Kaplan-meier分析發(fā)現(xiàn)無瘤生存期(DFS)MEG3表達高的患者生存期明顯長于MEG3低表達患者(p=0.003)。對dfs進行cox單因素分析,發(fā)現(xiàn)MEG3的表達、TNM分期和CEA與DFS顯著相關(guān)(p0.05);而其他臨床病理特征與結(jié)直腸癌患者DFS不相關(guān),不具有統(tǒng)計學(xué)意義。再采用多因素矯正后分析,發(fā)現(xiàn)MEG3的表達、結(jié)直腸癌的TNM分期和CEA是影響結(jié)直腸癌患者DFS的獨立風(fēng)險因素。2.MEG3的高表達抑制結(jié)直腸癌成瘤和轉(zhuǎn)移2.1CCK8實驗表明:與空質(zhì)粒對照組和空白對照組相比,MEG3過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞株后,細(xì)胞增殖活性明顯降低;與NC對照組和空白對照組相比,MEG3siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞株后,細(xì)胞增殖活性明顯增快。2.2Transwell實驗表明:MEG3過表達組比空質(zhì)粒對照組和空白對照組細(xì)胞遷移、侵襲能力明顯下降(p0.05)。MEG3siRNA轉(zhuǎn)染RKO細(xì)胞株后細(xì)胞遷移、侵襲能力明顯高于陰性對照和空白對照組(p0.01)2.3流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡實驗:MEG3過表達后可促進細(xì)胞株的凋亡。MEG3敲低后細(xì)胞凋亡能力明顯減低。2.4裸鼠皮下成瘤實驗表明:通過測量裸鼠皮下腫瘤體積,發(fā)現(xiàn)MEG3過表達組腫瘤組織體積明顯小于空載體對照組。2.5肺轉(zhuǎn)移瘤實驗表明:通過尾靜脈注射后取出裸鼠肺組織觀察轉(zhuǎn)移瘤個數(shù),MEG3過表達組肺轉(zhuǎn)移瘤個數(shù)明顯少于空載體對照組。3.VDR特異性結(jié)合MEG3上游啟動子區(qū)并激活MEG3的表達3.1生物物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)在MEG3子的啟動子區(qū)域存在VDR反應(yīng)元件結(jié)合位點。熒光素酶報告實驗發(fā)現(xiàn)VDR能夠激活含有MEG3啟動子區(qū)的熒光素酶報告基因質(zhì)粒。chip實驗檢測發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄起始點前-230~-243堿基區(qū)vdr抗體富集片段明顯,進一步證實了vdr能夠與MEG3上游啟動子區(qū)結(jié)合。3.2檢測VDR與MEG3的相關(guān)性:3.2.1SW1116細(xì)胞實驗組中,1α,25-(OH)_2D處理組24小時和48小時后MEG3的表達比無水乙醇對照組和空白對照組明顯升高(p0.001);RKO細(xì)胞實驗組中,處理48小時后1α,25-(OH)_2D處理組MEG3的表達量比無水乙醇對照組和空白對照組明顯升高(p0.05)。3.2.2轉(zhuǎn)染VDR過表達質(zhì)粒的sw1116細(xì)胞株和RKO細(xì)胞株中,在24、48和72小時以后MEG3表達水平明顯高于轉(zhuǎn)染空載體細(xì)胞株(p0.001),而且轉(zhuǎn)染時間越長,MEG3表達量越高。3.2.3在結(jié)直腸癌組織中VDR表達量越低MEG3的表達水平也越低,因此在結(jié)直腸癌組織中vdr和MEG3表達情況具有顯著相關(guān)性p0.001。3.2.4結(jié)直腸癌組織中VDR高表達患者總生存期明顯長于vdr低表達患者。4.MEG3特異性結(jié)合下游靶蛋白CLU抑制結(jié)直腸癌增殖、遷移和侵襲4.1通過生物素MEG3反義RNA進行RNA沉降實驗,發(fā)現(xiàn)與反義RNA和無磁珠對照比較獲得與MEG3特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)條帶,切膠并進行質(zhì)譜鑒定。經(jīng)質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)多個MEG3潛在結(jié)合蛋白分子。4.2RNA-pulldown結(jié)合特異抗體westernblot驗證發(fā)現(xiàn)lyar和在正義鏈和反義鏈及無磁珠對照組中沒有明顯的差異,CLU在正義鏈沉淀組中明顯富集,提示CLU有可能與MEG3結(jié)合。4.3RIP實驗證實:MEG3在CLU抗體沉淀組中明顯富集,提示MEG3能夠同CLU蛋白結(jié)合。4.4emsa實驗表明:MEG3能夠與CLU蛋白及CLU抗體結(jié)合形成RNA-蛋白-抗體三元復(fù)合物,證實MEG3能夠與CLU蛋白直接結(jié)合。4.5 MEG3截短實驗證實:MEG3 732-1174片段能夠與CLU蛋白特異性結(jié)合。4.6通過CCK8和Transwell實驗檢測SW1116/si-CLU、SW1116/MEG3,SW1116/MEG3/CLU及空白對照細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力,發(fā)現(xiàn)同時過表達MEG3和CLU的腸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力明顯高于單獨干擾CLU或MEG3過表達的腸癌細(xì)胞株,其增殖、遷移和侵襲能力與空白腸癌細(xì)胞相當(dāng),證實MEG3可以通過下游分子CLU參與結(jié)直腸癌的增殖、遷移和侵襲。四、研究結(jié)論:1.在組織水平發(fā)現(xiàn)MEG3在結(jié)直腸癌組織中表達水平明顯低于癌旁組織;MEG3的表達水平、臨床TNM分期、CEA水平與患者預(yù)后具有顯著相關(guān)性,而且MEG3低表達水平與結(jié)直腸癌患者的預(yù)后不良相關(guān)。2.MEG3作為腫瘤抑制基因抑制結(jié)直腸癌的成瘤和轉(zhuǎn)移。3.核轉(zhuǎn)錄因子VDR能夠特異性結(jié)合MEG3上游啟動子區(qū)VDR反應(yīng)元件的結(jié)合位點,結(jié)直腸癌組織和細(xì)胞中VDR可以促進MEG3表達增高,維生素D信號通路的異�；罨�可能是結(jié)直腸癌組織和細(xì)胞中MEG3異常表達的重要通路和方式。4.MEG3的732-1174區(qū)域能夠與下游靶蛋白分子CLU特異性結(jié)合形成RNA-蛋白復(fù)合物,降低癌基因CLU在結(jié)直腸癌中的穩(wěn)定性,進而抑制結(jié)直腸癌的增殖、遷移和轉(zhuǎn)移。
[Abstract]:1 . The effect of MEG3 on cell proliferation and invasion and metastasis of colorectal cancer was investigated by means of real - time quantitative polymerase chain reaction ( PCR ) . The expression of MEG3 was significantly lower than that in control group and blank control group ( p = 0.003 ) . The expression of MEG3 was significantly lower than that of control group and blank control group . Conclusion : The proliferation , migration and invasion ability of MEG3 and CLU in colorectal cancer cells were significantly higher than those of colorectal cancer cells .

【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R735.34

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本文編號：1383118