發(fā)布時間：2018-01-09 04:32

  本文關(guān)鍵詞：1.轉(zhuǎn)錄因子RUNX1與KLF4相互作用及轉(zhuǎn)錄調(diào)控對t（8；21）白血病細胞生物學(xué)功能的影響 2.新型LSD1抑制劑JL1037的抗白血病作用及其機制研究　出處：《北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

  更多相關(guān)文章： KLF4 轉(zhuǎn)錄調(diào)控 蛋白質(zhì)相互作用 白血病 生物學(xué)功能 LSD1抑制劑 白血病 增殖抑制 凋亡 細胞自噬

【摘要】：研究目的:實驗室前期用組蛋白去乙酰化酶抑制劑苯丁酸鈉(PB)誘導(dǎo)t(8;21)白血病細胞系Kasumi-1分化、凋亡時發(fā)現(xiàn),RUNX1、KLF4和P57的表達水平明顯升高,且通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)三者之間可能存在轉(zhuǎn)錄調(diào)控關(guān)系及蛋白質(zhì)相互作用。本研究旨在分析RUNX1、KLF4和P57之間的相互作用關(guān)系,并通過體外、體內(nèi)實驗探討RUNX1、KLF4和P57在t(8;21)白血病細胞中的生物學(xué)功能。研究方法:實時定量PCR技術(shù)和Western Blot技術(shù)檢測PB處理Kasumi-1細胞后RUNX1、KLF4和P57的mRNA和蛋白表達變化。構(gòu)建包含RUNX1結(jié)合位點的KLF4啟動子/增強子報告質(zhì)粒和包含KLF4結(jié)合位點的P57啟動子/增強子報告質(zhì)粒,雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)分析RUNX1、RUNX1-ETO對KLF4的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用以及KLF4對P57的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用,并應(yīng)用WesternBlot技術(shù)在蛋白水平進行驗證。免疫熒光共聚焦和免疫共沉淀技術(shù)檢測轉(zhuǎn)錄因子RUNX1、RUNX1-ETO與KLF4的共定位以及蛋白質(zhì)相互作用,明確具體的結(jié)合結(jié)構(gòu)域,并進一步探討PB能否抑制RUNX1、RUNX1-ETO與KLF4的結(jié)合。雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)分析RUNX1、RUNX1-ETO與KLF4結(jié)合對KLF4轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能的影響。構(gòu)建RUNX1、KLF4和P57的慢病毒表達載體,包裝病毒,感染Kasumi-1細胞,研究上述基因過表達對t(8;21)白血病細胞增殖、周期、凋亡和分化等生物學(xué)功能的影響。構(gòu)建KLF4和P57逆轉(zhuǎn)錄病毒表達載體,包裝病毒,感染t(8;21)白血病小鼠的骨髓白血病細胞,流式細胞儀分選陽性細胞,移植受體小鼠,研究KLF4和P57過表達對t(8;21)白血病小鼠發(fā)病率和生存期的影響。研究結(jié)果:PB處理Kasumi-1細胞后,RUNX1、KLF4和P57的mRNA和蛋白表達水平均明顯升高。RUNX1以劑量依賴性的方式激活KLF4啟動子/增強子報告質(zhì)粒,而RUNX1-ETO對KLF4啟動子/增強子報告質(zhì)粒的轉(zhuǎn)錄激活作用明顯減弱。KLF4對P57啟動子/增強子報告質(zhì)粒亦存在劑量依賴性的激活作用。在細胞系中過表達RUNX1可以上調(diào)KLF4和P57的蛋白表達;而過表達RUNX1-ETO對KLF4和P57的蛋白表達無明顯影響;過表達KLF4,P57的蛋白表達升高。RUNX1、RUNX1-ETO與KLF4均存在蛋白質(zhì)相互作用,且共定位于細胞核內(nèi)。RUNX1通過RUNT同源結(jié)構(gòu)域(Runt homology domain,RHD)與 KLF4 結(jié)合,RUNX1-ETO 除 了通過 RHD 還通過ETO部分與KLF4結(jié)合。RUNX1-ETO競爭性地抑制野生型RUNX1與KLF4的結(jié)合,組蛋白去乙�；�酶抑制劑PB不影響RUNX1、RUNX1-ETO與KLF4的結(jié)合。RUNX1與KLF4結(jié)合促進KLF4對下游靶基因的轉(zhuǎn)錄激活,而RUNX1-ETO與KLF4結(jié)合對下游靶基因轉(zhuǎn)錄并無明顯的促進作用。在t(8;21)白血病細胞中過表達RUNX1、KLF4和P57均能抑制細胞增殖、阻滯細胞周期、促進細胞凋亡,此外,KLF4還具有誘導(dǎo)白血病細胞分化的生物學(xué)功能。體內(nèi)實驗結(jié)果表明,KLF4和P57過表達可以降低t(8;21)白血病小鼠的發(fā)病率。研究結(jié)論:本研究發(fā)現(xiàn)了(8;21)白血病細胞系中RUNX1 → KLF4-P57新的調(diào)控信號通路,RUNX1通過轉(zhuǎn)錄激活KLF4進而激活P57抑制t(8;21)白血病細胞增殖、阻滯細胞周期、誘導(dǎo)細胞凋亡。而當(dāng)RUNX1發(fā)生染色體易位形成RUNX1-ETO融合蛋白時,上述作用消失。此外,RUNX1還通過與KLF4發(fā)生蛋白質(zhì)相互作用,進一步增強KLF4對下游靶基因的轉(zhuǎn)錄激活,上述作用可以被RUNX1-ETO競爭性地抑制。本研究闡明了轉(zhuǎn)錄因子RUNX1與KLF4之間的作用關(guān)系以及RUNX1-ETO融合蛋白對這種作用關(guān)系的影響。研究目的:組蛋白賴氨酸特異性去甲基化酶1(LSD1)在白血病中高水平表達且與預(yù)后不良相關(guān),敲降LSD1的表達或藥物抑制LSD1的活性可以顯著降低白血病干細胞的集落形成能力,延長白血病小鼠的生存時間。因此,設(shè)計并合成高效低毒的LSD1抑制劑有望成為白血病治療的新策略。JL1037是一個高效、高選擇性、可逆性的新型LSD1抑制劑,本研究旨在探討該化合物在體外和體內(nèi)對于白血病細胞的殺傷作用以及相關(guān)分子機制。研究方法:實時定量PCR技術(shù)和Western Blot技術(shù)檢測LSD1在白血病細胞系和正常人骨髓單個核細胞中的表達水平,篩選高表達LSD1的細胞系用于后續(xù)細胞功能實驗;Western blot檢測JL1037對LSD1底物組蛋白H3K4、H3K9甲基化水平以及對組蛋白H3乙�；�水平的影響;MTS法檢測JL1037對白血病細胞增殖能力的影響,用SPSS軟件計算半數(shù)抑制劑量(IC50);流式細胞術(shù)檢測JL1037對細胞周期分布、細胞凋亡的影響,瑞氏染色觀察不同濃度的藥物處理后細胞形態(tài)學(xué)的變化;Western blot檢測JL1037處理后細胞周期蛋白(P21、P27、P57)、細胞凋亡相關(guān)蛋白(Caspase 3、PARP)和BCL-2 家族蛋白(BCL-2、BCL-XL、BAX)表達變化。構(gòu)建LSD1 shRNA慢病毒載體,包裝病毒,感染THP-1和Kasumi-1細胞,敲降LSD1的表達,進一步驗證JL1037是否通過特異性作用于LSD1這一靶點發(fā)揮生物學(xué)功能。免疫熒光染色和Western Blot檢測JL1037對自噬相關(guān)蛋白LC-3 II表達和分布的影響,透射電鏡觀察JL1037處理后細胞內(nèi)自噬小體、自噬溶酶體的形成情況;將JL1037和自噬抑制劑氯喹(CQ)單獨及聯(lián)合應(yīng)用,檢測細胞凋亡情況;Ficoll法分離正常供者和AML患者骨髓單個核細胞,免疫磁珠法分選臍帶血CD34+造血干/祖細胞,流式細胞術(shù)檢測JL1037對上述細胞凋亡的影響,將JL1037與氯喹(CQ)單獨及聯(lián)合應(yīng)用,進一步檢測細胞的凋亡情況。體內(nèi)治療實驗使用共表達AML1-ETO和C-KITD816V的白血病小鼠模型,實驗小鼠隨機分為三組,分別通過尾靜脈注射JL1037(2.5mg/kg.d、5mg/kg.d)和PBS進行治療,動態(tài)監(jiān)測小鼠體重及外周血白血病細胞比例的變化,記錄并比較各組小鼠的生存期有無差異。藥物毒性實驗使用正常的C57BL/6小鼠,尾靜脈注射PBS和JL1037(5mg/kg.d),連續(xù)10天,給藥結(jié)束后處死小鼠,比較兩組小鼠器官重量和器官組織學(xué)形態(tài)有無差異。研究結(jié)果:LSD1 mRNA和蛋白在白血病細胞系中的表達水平顯著高于正常人骨髓單個核細胞,以Kasumi-1、K562和THP-1細胞最為顯著。JL1037處理THP-1和Kasumi-1細胞后,組蛋白H3K4的單、雙甲基化水平升高,呈現(xiàn)劑量依賴性,組蛋白H3K9的甲基化水平和組蛋白H3的乙�；�水平無明顯變化。JL1037對THP-1和Kasumi-1細胞的增殖有顯著的抑制作用,48h的IC50分別為(30.3±2.22)μM和(19.42±3.02)μM。JL1037激活caspase依賴的細胞凋亡,且呈現(xiàn)劑量依賴性,同時激活線粒體凋亡信號通路,表現(xiàn)為促凋亡蛋白Bax表達上調(diào)以及抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-XL表達下調(diào)。低劑量的JL1037阻滯細胞周期于S期,隨著藥物濃度的增加,細胞周期被阻滯于G0/G1期,相關(guān)機制研究表明JL1037上調(diào)細胞周期相關(guān)蛋白P21和P57表達。LSD1敲降實驗證實,JL1037通過作用于LSD1這一靶點發(fā)揮生物學(xué)作用。細胞自噬實驗結(jié)果顯示,JL1037處理后細胞內(nèi)自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ的表達水平顯著上調(diào),細胞內(nèi)出現(xiàn)自噬小體和自噬溶酶體,自噬抑制劑氯喹(CQ)與JL1037聯(lián)合使用將進一步促進白血病細胞凋亡。同時,JL1037顯著促進急性髓系白血病患者的原代細胞凋亡而對正常的造血細胞作用相對較弱。在體內(nèi)實驗中,JL1037抑制t(8;21)白血病的進展,顯著延長白血病小鼠的生存期,同時顯示出了一定程度的毒性作用。研究結(jié)論:本研究通過體外體內(nèi)實驗,證實了新型LSD1抑制劑JL1037具有抑制白血病細胞增殖、阻滯細胞周期、誘導(dǎo)細胞凋亡和激活細胞自噬反應(yīng)等生物學(xué)效應(yīng),是白血病治療的潛在有效藥物。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R733.7

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本文編號：1400039