發(fā)布時(shí)間：2018-01-09 04:32

  本文關(guān)鍵詞：1.轉(zhuǎn)錄因子RUNX1與KLF4相互作用及轉(zhuǎn)錄調(diào)控對(duì)t（8；21）白血病細(xì)胞生物學(xué)功能的影響 2.新型LSD1抑制劑JL1037的抗白血病作用及其機(jī)制研究　出處：《北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院》2017年博士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

  更多相關(guān)文章： KLF4 轉(zhuǎn)錄調(diào)控 蛋白質(zhì)相互作用 白血病 生物學(xué)功能 LSD1抑制劑 白血病 增殖抑制 凋亡 細(xì)胞自噬

【摘要】：研究目的:實(shí)驗(yàn)室前期用組蛋白去乙�；�酶抑制劑苯丁酸鈉(PB)誘導(dǎo)t(8;21)白血病細(xì)胞系Kasumi-1分化、凋亡時(shí)發(fā)現(xiàn),RUNX1、KLF4和P57的表達(dá)水平明顯升高,且通過(guò)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)三者之間可能存在轉(zhuǎn)錄調(diào)控關(guān)系及蛋白質(zhì)相互作用。本研究旨在分析RUNX1、KLF4和P57之間的相互作用關(guān)系,并通過(guò)體外、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)探討RUNX1、KLF4和P57在t(8;21)白血病細(xì)胞中的生物學(xué)功能。研究方法:實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)和Western Blot技術(shù)檢測(cè)PB處理Kasumi-1細(xì)胞后RUNX1、KLF4和P57的mRNA和蛋白表達(dá)變化。構(gòu)建包含RUNX1結(jié)合位點(diǎn)的KLF4啟動(dòng)子/增強(qiáng)子報(bào)告質(zhì)粒和包含KLF4結(jié)合位點(diǎn)的P57啟動(dòng)子/增強(qiáng)子報(bào)告質(zhì)粒,雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)分析RUNX1、RUNX1-ETO對(duì)KLF4的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用以及KLF4對(duì)P57的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用,并應(yīng)用WesternBlot技術(shù)在蛋白水平進(jìn)行驗(yàn)證。免疫熒光共聚焦和免疫共沉淀技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子RUNX1、RUNX1-ETO與KLF4的共定位以及蛋白質(zhì)相互作用,明確具體的結(jié)合結(jié)構(gòu)域,并進(jìn)一步探討PB能否抑制RUNX1、RUNX1-ETO與KLF4的結(jié)合。雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)分析RUNX1、RUNX1-ETO與KLF4結(jié)合對(duì)KLF4轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能的影響。構(gòu)建RUNX1、KLF4和P57的慢病毒表達(dá)載體,包裝病毒,感染Kasumi-1細(xì)胞,研究上述基因過(guò)表達(dá)對(duì)t(8;21)白血病細(xì)胞增殖、周期、凋亡和分化等生物學(xué)功能的影響。構(gòu)建KLF4和P57逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體,包裝病毒,感染t(8;21)白血病小鼠的骨髓白血病細(xì)胞,流式細(xì)胞儀分選陽(yáng)性細(xì)胞,移植受體小鼠,研究KLF4和P57過(guò)表達(dá)對(duì)t(8;21)白血病小鼠發(fā)病率和生存期的影響。研究結(jié)果:PB處理Kasumi-1細(xì)胞后,RUNX1、KLF4和P57的mRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯升高。RUNX1以劑量依賴(lài)性的方式激活KLF4啟動(dòng)子/增強(qiáng)子報(bào)告質(zhì)粒,而RUNX1-ETO對(duì)KLF4啟動(dòng)子/增強(qiáng)子報(bào)告質(zhì)粒的轉(zhuǎn)錄激活作用明顯減弱。KLF4對(duì)P57啟動(dòng)子/增強(qiáng)子報(bào)告質(zhì)粒亦存在劑量依賴(lài)性的激活作用。在細(xì)胞系中過(guò)表達(dá)RUNX1可以上調(diào)KLF4和P57的蛋白表達(dá);而過(guò)表達(dá)RUNX1-ETO對(duì)KLF4和P57的蛋白表達(dá)無(wú)明顯影響;過(guò)表達(dá)KLF4,P57的蛋白表達(dá)升高。RUNX1、RUNX1-ETO與KLF4均存在蛋白質(zhì)相互作用,且共定位于細(xì)胞核內(nèi)。RUNX1通過(guò)RUNT同源結(jié)構(gòu)域(Runt homology domain,RHD)與 KLF4 結(jié)合,RUNX1-ETO 除 了通過(guò) RHD 還通過(guò)ETO部分與KLF4結(jié)合。RUNX1-ETO競(jìng)爭(zhēng)性地抑制野生型RUNX1與KLF4的結(jié)合,組蛋白去乙�；�酶抑制劑PB不影響RUNX1、RUNX1-ETO與KLF4的結(jié)合。RUNX1與KLF4結(jié)合促進(jìn)KLF4對(duì)下游靶基因的轉(zhuǎn)錄激活,而RUNX1-ETO與KLF4結(jié)合對(duì)下游靶基因轉(zhuǎn)錄并無(wú)明顯的促進(jìn)作用。在t(8;21)白血病細(xì)胞中過(guò)表達(dá)RUNX1、KLF4和P57均能抑制細(xì)胞增殖、阻滯細(xì)胞周期、促進(jìn)細(xì)胞凋亡,此外,KLF4還具有誘導(dǎo)白血病細(xì)胞分化的生物學(xué)功能。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,KLF4和P57過(guò)表達(dá)可以降低t(8;21)白血病小鼠的發(fā)病率。研究結(jié)論:本研究發(fā)現(xiàn)了(8;21)白血病細(xì)胞系中RUNX1 → KLF4-P57新的調(diào)控信號(hào)通路,RUNX1通過(guò)轉(zhuǎn)錄激活KLF4進(jìn)而激活P57抑制t(8;21)白血病細(xì)胞增殖、阻滯細(xì)胞周期、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。而當(dāng)RUNX1發(fā)生染色體易位形成RUNX1-ETO融合蛋白時(shí),上述作用消失。此外,RUNX1還通過(guò)與KLF4發(fā)生蛋白質(zhì)相互作用,進(jìn)一步增強(qiáng)KLF4對(duì)下游靶基因的轉(zhuǎn)錄激活,上述作用可以被RUNX1-ETO競(jìng)爭(zhēng)性地抑制。本研究闡明了轉(zhuǎn)錄因子RUNX1與KLF4之間的作用關(guān)系以及RUNX1-ETO融合蛋白對(duì)這種作用關(guān)系的影響。研究目的:組蛋白賴(lài)氨酸特異性去甲基化酶1(LSD1)在白血病中高水平表達(dá)且與預(yù)后不良相關(guān),敲降LSD1的表達(dá)或藥物抑制LSD1的活性可以顯著降低白血病干細(xì)胞的集落形成能力,延長(zhǎng)白血病小鼠的生存時(shí)間。因此,設(shè)計(jì)并合成高效低毒的LSD1抑制劑有望成為白血病治療的新策略。JL1037是一個(gè)高效、高選擇性、可逆性的新型LSD1抑制劑,本研究旨在探討該化合物在體外和體內(nèi)對(duì)于白血病細(xì)胞的殺傷作用以及相關(guān)分子機(jī)制。研究方法:實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)和Western Blot技術(shù)檢測(cè)LSD1在白血病細(xì)胞系和正常人骨髓單個(gè)核細(xì)胞中的表達(dá)水平,篩選高表達(dá)LSD1的細(xì)胞系用于后續(xù)細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn);Western blot檢測(cè)JL1037對(duì)LSD1底物組蛋白H3K4、H3K9甲基化水平以及對(duì)組蛋白H3乙�；�水平的影響;MTS法檢測(cè)JL1037對(duì)白血病細(xì)胞增殖能力的影響,用SPSS軟件計(jì)算半數(shù)抑制劑量(IC50);流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)JL1037對(duì)細(xì)胞周期分布、細(xì)胞凋亡的影響,瑞氏染色觀(guān)察不同濃度的藥物處理后細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化;Western blot檢測(cè)JL1037處理后細(xì)胞周期蛋白(P21、P27、P57)、細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白(Caspase 3、PARP)和BCL-2 家族蛋白(BCL-2、BCL-XL、BAX)表達(dá)變化。構(gòu)建LSD1 shRNA慢病毒載體,包裝病毒,感染THP-1和Kasumi-1細(xì)胞,敲降LSD1的表達(dá),進(jìn)一步驗(yàn)證JL1037是否通過(guò)特異性作用于LSD1這一靶點(diǎn)發(fā)揮生物學(xué)功能。免疫熒光染色和Western Blot檢測(cè)JL1037對(duì)自噬相關(guān)蛋白LC-3 II表達(dá)和分布的影響,透射電鏡觀(guān)察JL1037處理后細(xì)胞內(nèi)自噬小體、自噬溶酶體的形成情況;將JL1037和自噬抑制劑氯喹(CQ)單獨(dú)及聯(lián)合應(yīng)用,檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況;Ficoll法分離正常供者和AML患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞,免疫磁珠法分選臍帶血CD34+造血干/祖細(xì)胞,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)JL1037對(duì)上述細(xì)胞凋亡的影響,將JL1037與氯喹(CQ)單獨(dú)及聯(lián)合應(yīng)用,進(jìn)一步檢測(cè)細(xì)胞的凋亡情況。體內(nèi)治療實(shí)驗(yàn)使用共表達(dá)AML1-ETO和C-KITD816V的白血病小鼠模型,實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為三組,分別通過(guò)尾靜脈注射JL1037(2.5mg/kg.d、5mg/kg.d)和PBS進(jìn)行治療,動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)小鼠體重及外周血白血病細(xì)胞比例的變化,記錄并比較各組小鼠的生存期有無(wú)差異。藥物毒性實(shí)驗(yàn)使用正常的C57BL/6小鼠,尾靜脈注射PBS和JL1037(5mg/kg.d),連續(xù)10天,給藥結(jié)束后處死小鼠,比較兩組小鼠器官重量和器官組織學(xué)形態(tài)有無(wú)差異。研究結(jié)果:LSD1 mRNA和蛋白在白血病細(xì)胞系中的表達(dá)水平顯著高于正常人骨髓單個(gè)核細(xì)胞,以Kasumi-1、K562和THP-1細(xì)胞最為顯著。JL1037處理THP-1和Kasumi-1細(xì)胞后,組蛋白H3K4的單、雙甲基化水平升高,呈現(xiàn)劑量依賴(lài)性,組蛋白H3K9的甲基化水平和組蛋白H3的乙酰化水平無(wú)明顯變化。JL1037對(duì)THP-1和Kasumi-1細(xì)胞的增殖有顯著的抑制作用,48h的IC50分別為(30.3±2.22)μM和(19.42±3.02)μM。JL1037激活caspase依賴(lài)的細(xì)胞凋亡,且呈現(xiàn)劑量依賴(lài)性,同時(shí)激活線(xiàn)粒體凋亡信號(hào)通路,表現(xiàn)為促凋亡蛋白Bax表達(dá)上調(diào)以及抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-XL表達(dá)下調(diào)。低劑量的JL1037阻滯細(xì)胞周期于S期,隨著藥物濃度的增加,細(xì)胞周期被阻滯于G0/G1期,相關(guān)機(jī)制研究表明JL1037上調(diào)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白P21和P57表達(dá)。LSD1敲降實(shí)驗(yàn)證實(shí),JL1037通過(guò)作用于LSD1這一靶點(diǎn)發(fā)揮生物學(xué)作用。細(xì)胞自噬實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,JL1037處理后細(xì)胞內(nèi)自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ的表達(dá)水平顯著上調(diào),細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)自噬小體和自噬溶酶體,自噬抑制劑氯喹(CQ)與JL1037聯(lián)合使用將進(jìn)一步促進(jìn)白血病細(xì)胞凋亡。同時(shí),JL1037顯著促進(jìn)急性髓系白血病患者的原代細(xì)胞凋亡而對(duì)正常的造血細(xì)胞作用相對(duì)較弱。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中,JL1037抑制t(8;21)白血病的進(jìn)展,顯著延長(zhǎng)白血病小鼠的生存期,同時(shí)顯示出了一定程度的毒性作用。研究結(jié)論:本研究通過(guò)體外體內(nèi)實(shí)驗(yàn),證實(shí)了新型LSD1抑制劑JL1037具有抑制白血病細(xì)胞增殖、阻滯細(xì)胞周期、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和激活細(xì)胞自噬反應(yīng)等生物學(xué)效應(yīng),是白血病治療的潛在有效藥物。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：R733.7

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本文編號(hào)：1400039