發(fā)布時間：2018-01-09 08:00

  本文關(guān)鍵詞：針刺調(diào)節(jié)抑郁大鼠海馬AMPA受體及突觸相關(guān)蛋白表達的研究　出處：《廣州中醫(yī)藥大學》2017年博士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：目的:突觸后神經(jīng)元的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)受體AMPA受體是抑郁障礙病理生理的重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)和抑郁治療的重要靶點。本實驗通過針刺改善慢性不可預見性溫和刺激(Chronic unpredictable mild stress,CUMS)聯(lián)合孤養(yǎng)致抑郁模型大鼠行為學和針刺調(diào)節(jié)抑郁大鼠海馬突觸相關(guān)蛋白及AMPA受體亞基表達,來探討針刺在"谷氨酸-AMPA受體"突觸傳遞及相關(guān)突觸蛋白表達中的抗抑郁機制。實驗一針刺對CUMS聯(lián)合孤養(yǎng)抑郁模型大鼠行為學的影響方法:選用體重180-220g的成年雄牲SD大鼠30只,隨機的分為5組:空白組(n=6),42天造模組,21天造模組,21天造模+針刺組,42天造模+針刺組。其中空白組6只大鼠一起飼養(yǎng)在同一籠子中,其余各組大鼠均采用孤養(yǎng)模型,即單籠飼養(yǎng)。空白組大鼠接受42天普通飼料喂養(yǎng);21天造模組大鼠,接受42天普通飼料喂養(yǎng)的同時在第1天到第21天連續(xù)21天進行慢性不可預見性溫和刺激(CUMS)造模;42天造模組大鼠,在接受42天普通飼料喂養(yǎng)的同時進行連續(xù)42天慢性不可預見性溫和刺激(CUMS)造模;21天造模+針刺組大鼠,接受42天普通飼料喂養(yǎng)的同時在第1天到第21天連續(xù)21天進行慢性不可預見性溫和刺激(CUMS)造模,在第22天接受四關(guān)穴針刺治療,隔日一次,連續(xù)治療21天;42天造模+針刺組大鼠,在接受42天普通飼料喂養(yǎng)的同時進行連續(xù)42天慢性不可預見性溫和刺激(CUMS)造模,在第22天接受四關(guān)穴針刺治療,隔日一次,連續(xù)治療21天。在實驗開始前(Day0),第21天(Day21),第42天(Day42)對各組大鼠進行糖水偏好實驗(Sucrose Preference Test,SPT)測量。在實驗第一天(Day1),第22天(Day22)和第42天(Day42)對各組大鼠進行曠場實驗(Open Filed Test,OFT)測量。在實驗開始前(Day0),實驗第20天(Day20)和實驗第40天(Day40)對各組大鼠進行高架十字迷宮實驗(The Elevated Plus Maze Test,EMT)測量。即實驗第二天(Day2),實驗第21天(Day21)和實驗第42天(Day42)對各組大鼠進行避暗實驗(Passive Avoidance Test,PAT)測量。統(tǒng)計方法:采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析,實驗計量資料若服從正太分布,結(jié)果以均數(shù)±標準差(x±s),各組間差異及比較采用單因素方差分析(One-ANOVA)最小顯著差法(LSD),以p0.05為有統(tǒng)計學意義。組間比較采用方差分析,不服從正態(tài)分布或方差不齊,采用非參數(shù)秩和檢驗;多個不同時間比較采用重復測量方差分析,不滿足協(xié)方差矩陣或球形檢驗采用矯正檢驗方法及兩兩比較,或者采用多遠方差分析,檢驗水平α =0.05。結(jié)果:1.糖水偏好實驗結(jié)果顯示:在實驗開始前(Day0),各組大鼠糖水偏好值并沒有統(tǒng)計學差異,F_(4,25)= 0.089,p ＞ 0.05。在第 21 天(Day21),4 組 CUMS 造模組大鼠,即42天造模組、21天造模組、21天造模+針刺組、42天造模+針刺組,均與空白組有統(tǒng)計學差異,F(425)= 10.246,p0.01。在第42天,各組間的糖水偏好值均有統(tǒng)計學差異,F_(4,25)= 24.578,p0.01。經(jīng)過42天CUMS造模后,42天造模組的糖水好值均明顯低于空白組(P0.01),21天造模組(P0.01)和42天造模加針刺組(P0.01)。從實驗第22天開始,盡管21天造模組的糖水偏好值在第42天(Day42)較第21天(Day21)有所升高,其偏好值仍然低于空白組(P0.01)。Group D在接受21天針刺治療后,偏好值明顯有所升高,且與空白組(P0.01)沒有顯著統(tǒng)計學差異,并且21天造模+針刺組的值高于42天造模組(P0.01),21天造模組(P0.01)和42天造模+針刺組(P0.01)。2.曠場實驗主要觀察大鼠在場箱里的水平運動總路程(Crossings)和爬壁站立次數(shù)(Rearings),結(jié)果顯示:在第一次實驗中(Day1),5組大鼠場箱內(nèi)水平運動總路程和爬壁站立次數(shù)沒有統(tǒng)計學差異,F_(4,25)= 0.025,p0.05;F_(4,25)= 0.026,p0.05。實驗第22天(Day22),4組CUMS造模組大鼠,即42天造模組、21天造模組、21天造模+針刺組、42天造模+針刺組均與空白組有統(tǒng)計學差異,p0.01。在試驗第42天(Day42),5組大鼠場箱內(nèi)水平運動總路程和爬壁站立次數(shù)有顯著統(tǒng)計學差異,P(4,25)= 5.35,p0.01;P(4,25)= 5.34,p0.01。21 天造模+針刺組大鼠水平運動總路程和爬壁站立次數(shù)與空白組相近,21天造模+針刺組和空白組均明顯高于42天造模組和21天造模組(p0.01;p0.01);42天造模+針刺組明顯高于42天造模組(p0.01)。3.高架十字迷宮實驗主要觀察分析各組大鼠在開臂及閉臂中活動時間比值,結(jié)果顯示:在第一次實驗中(Day0)各組大鼠實驗結(jié)果并沒有統(tǒng)計學差異,F_(4,25)= 0.085,P ＞ 0.05。經(jīng)過 20 天 CUMS 造模后,F_(4,25)= 10.246,p0.01,4 組 CUMS 造模組大鼠,即42天造模組、21天造模組、21天造模+針刺組、42天造模+針刺組,均與空白組有統(tǒng)計學差異(P0.01)。在第三重測量中(Day40),5組大鼠比值具有統(tǒng)計學差異,F(4.25)= 6.179,p0.01。從組間比較來看,空白組的比值均高于其他組,F_(4,25)=34.946,p0.01�？瞻捉M和21天造模+針刺組,43天造模組和21天造模組以及21天造模+針刺組和42天造模+針刺組之間并沒有統(tǒng)計學差異,P0.05。21天造模+針刺組高于42天造模組(P0.05)和21天造模組(P0.05)。4.避暗實驗主要觀察分析大鼠的潛伏期,結(jié)果顯示:在第一次避暗實驗中(Day2),各組大鼠的潛伏期并沒有統(tǒng)計學差異,(F_(4,25)= 0.186,p0.01)。在第二次試驗中(F_(4,25)= 45.675,p0.01),各組大鼠的潛伏期并具有顯著統(tǒng)計學差異,空白組潛伏期明顯短于其他4 CUMS造模組。在試驗第42天(Day42),各組大鼠潛伏期具有顯著統(tǒng)計學差異,F_(4,25)= 45.675,p0.01。從組間比較看,空白組明顯低于其他各組(P0.05);21天造模+針刺組低于42天造模組(P0.01),21天造模組(P0.01)和42天造模+針刺組(P0.01)。5.本研究證實:(1)21和42天兩種CUMS造模方式的大鼠都會出現(xiàn)明顯抑郁樣行為,且42天CUMS模型大鼠抑郁樣行為更嚴重;(2)大鼠在經(jīng)過21天CUMS刺激出現(xiàn)抑郁樣行為,繼續(xù)給予21天CUMS刺激抑郁樣癥狀會加重,但是加重的趨勢緩慢;(3)大鼠在經(jīng)過21天CUMS刺激出現(xiàn)抑郁樣行為后,不再繼續(xù)給予CUMS刺激,其抑郁樣行為雖然有所恢復仍然可以維持3周;(4)針刺可以良好的改善CUMS抑郁模型大鼠的抑郁樣行為,針刺具有抗抑郁療效;(5)針刺可改善不同輕重程度CUMS抑郁模型大鼠的抑郁樣行為,且抑郁程度越輕療效越明顯。實驗二針刺對CUMS聯(lián)合孤養(yǎng)抑郁模型大鼠海馬突觸相關(guān)蛋白及AMPA受體亞基表達的影響方法:選用體重180-220g的成年雄性SD大鼠30只,隨機分5組:空白組;CUMS模型組;CUMS+針刺組;CUMS+假針刺組;CUMS+針刺+側(cè)腦室注射AMPA受體阻斷劑預處理組,每組6只�？瞻捉M6只大鼠一起飼養(yǎng)在同一籠子中,其余各組大鼠均采用孤養(yǎng)模型,即單籠飼養(yǎng)�？瞻捉M:大鼠接受42天普通飼料喂養(yǎng);CUMS模型組:大鼠接受連續(xù)42天普通飼料喂養(yǎng)的同時進行連續(xù)42天慢性不可預見性溫和刺激(CUMS)造模;CUMS+針刺組:大鼠接受連續(xù)42天普通飼料喂養(yǎng)的同時進行連續(xù)42天慢性不可預見性溫和刺激CUMS)造模,第22天接受四關(guān)穴針刺治療,隔日一次,連續(xù)治療21天。CUMS+假針刺組:大鼠接受連續(xù)42天普通飼料喂養(yǎng)的同時進行連續(xù)42天慢性不可預見性溫和刺激(CUMS)造模,第22天接受四關(guān)穴假針刺治療,假針刺組取穴針刺時間均同針刺組,但針刺時不刺入皮下,隔日一次,連續(xù)治療21天。CUMS+針刺+側(cè)腦室注射AMPA受體阻斷劑預處理組:大鼠接受連續(xù)42天普通飼料喂養(yǎng)的同時進行連續(xù)42天慢性不可預見性溫和刺激(CUMS)造模,第22天接受四關(guān)穴針刺治療,在每次針刺治療前給予大鼠側(cè)腦室注AMPA受體阻斷劑NBQX,30min后再給予針刺,隔日一次,連續(xù)治療21天。采用Western Blot及免疫熒光雙標技術(shù)觀察針刺對CUMS聯(lián)合孤養(yǎng)抑郁模型大鼠海馬突觸相關(guān)蛋白CaMKⅡ、Stargazin、PSD-95、PICK1、p-GLUR1、P-GLUR2、GLUR1、GLUR2 及 AMPA 受體亞基 GluR1、GluR2 的表達情況。結(jié)果:通過Western Blot的實驗結(jié)果分析可見:與空白組比較,CUMS模型組和CUMS+針刺+AMPA阻斷劑預處理組大鼠海馬Stargazin蛋白含量均明顯降低,分別比較均有顯著性差異(P=0.000,P=0.000);與空白組比較,CUMS+針刺組大鼠海馬Stargazin含量沒有顯著性差異(P=0.498);與空白組比較,CUMS+假針刺組大鼠海馬Stargazin蛋白含量增加,且有顯著性差異(P=0.01);CUMS模型組與CUMS模型+針刺+AMPA受體阻斷劑預處理組,CUMS+假針刺組與CUMS模型+針刺+AMPA受體阻斷劑預處理組兩兩比較無顯著性差異。(P=0.061,P=0.227)。與空白組比較,CUMS模型組、CUMS+假針刺組和CUMS+針刺+AMPA阻斷劑預處理組大鼠海馬p-GLUR1蛋白含量均明顯降低,分別比較均有顯著性差異(P=0.000,P=0.000,P=0.000,);與空白組比較,CUMS+針刺組大鼠海馬 p-GLUR1含量沒有顯著性差異(P=0.056);與CUMS模型組比較,CUMS+針刺組和CUMS+假針刺組大鼠海馬p-GLUR1蛋白含量增加,且有顯著性差異(P=0.00,P=0.01);CUMS模型組與CUMS模型+針刺+AMPA受體阻斷劑預處理組兩兩比較無顯著性差異(P=0.235);CUMS+假針刺組與CUMS模型+針刺+AMPA受體阻斷劑預處理組兩兩比較有顯著性差異(P=0.025)。與空白組比較,CUMS模型組、CUMS+假針刺組和CUMS+針刺+AMPA阻斷劑預處理組大鼠海馬P-GLUR2蛋白含量均明顯降低,分別比較均有顯著性差異(P=0.000,P=0.000,P=0.000,);與空白組比較,CUMS+針刺組大鼠海馬 P-GLUR2含量沒有顯著性差異(P=0.077);與CUMS模型組比較,CUMS+針刺組和CUMS+假針刺組大鼠海馬P-GLUR2蛋白含量增加,且有顯著性差異(P=0.00,P=0.000);CUMS模型組與CUMS模型+針刺+AMPA受體阻斷劑預處理組兩兩比較無顯著性差異(P=0.091);CUMS+假針刺組與CUMS模型+針刺+AMPA受體阻斷劑預處理組兩兩比較有顯著性差異(P=0.012)。與空白組比較,CUMS模型組、CUMS+假針刺組和CUMS+針刺+AMPA阻斷劑預處理組大鼠海馬p-CamkⅡI蛋白含量均明顯降低,分別比較均有顯著性差異(P=0.000,P=0.000,P=0.000,);與空白組比較,CUMS+針刺組大鼠海馬p-CamkⅡ含量沒有顯著性差異(P=0.332);與CUMS模型組比較,CUMS+針刺組和CUMS+假針刺組大鼠海馬p-CamkⅡ蛋白含量增加,且有顯著性差異(P=0.000,P=0.200);CUMS模型組與CUMS模型+針刺+AMPA受體阻斷劑預處理組兩兩比較無顯著性差異(P=0.210);CUMS+假針刺組與CUMS模型+針刺+AMPA受體阻斷劑預處理組兩兩比較無顯著性差異(P=0.242)。與空白組比較,CUMS模型組、CUMS+針刺組、CUMS+假針刺組和CUMS+針刺+AMPA阻斷劑預處理組大鼠海馬Pick1蛋白含量均明顯降低,分別比較均有顯著性差異(P=0.000,P=0.027,P=0.000,P=0.000);與 CUMS 模型組比較,CUMS+針刺組和CUMS+假針刺組大鼠海馬Pick1蛋白含量增加,且有顯著性差異(P=0.000,P=0.000);CUMS模型組與CUMS模型+針刺+AMPA受體阻斷劑預處理組兩兩比較無顯著性差異(P=0.064);CUMS+假針刺組與CUMS模型+針刺+AMPA受體阻斷劑預處理組兩兩比較,大鼠海馬Pick1蛋白含量均明顯增加,并且有顯著性差異(P=0.2)。CUMS+假針刺組與CUMS模型+針刺組兩兩比較,大鼠海馬Pick1蛋白含量均明顯降低,并且有顯著性差異(P=0.002)。與空白組比較,CUMS模型組、CUMS+針刺組、CUMS+假針刺組和CUMS+針刺+AMPA阻斷劑預處理組大鼠海馬PSD95蛋白含量均明顯降低,分別比較均有顯著性差異(P=0.000,P=0.008,P=0.000,P=0.000);與 CUMS 模型組比較,CUMS+針刺組和CUMS+假針刺組大鼠海馬PSD95蛋白含量增加,且有顯著性差異(P=0.000,P=0.000);CUMS模型組與CUMS模型+針刺+AMPA受體阻斷劑預處理組兩兩比較無顯著性差異(P=0.368);CUMS+假針刺組與CUMS模型+針刺組兩兩比較無顯著性差異(P=0.062);CUMS+假針刺組與CUMS模型+針刺+AMPA受體阻斷劑預處理組兩兩比較,大鼠海馬PSD95蛋白含量均明顯增加,并且有顯著性差異(P=0.001)。與空白組比較,CUMS模型組、CUMS+針刺組、CUMS+假針刺組和CUMS+針刺+AMPA阻斷劑預處理組大鼠海馬GLUR1蛋白含量均明顯降低,分別比較均有顯著性差異(P=0.000,P=0.001,P=0.000,P=0.000);與 CUMS 模型組比較,CUMS+針刺組和CUMS+假針刺組大鼠海馬GLUR1蛋白含量增加,且有顯著性差異(P=0.000,P=0.02);CUMS模型組與CUMS模型+針刺+AMPA受體阻斷劑預處理組兩兩比較無顯著性差異(P=0.118);CUMS+假針刺組與CUMS模型+針刺組兩兩比較大鼠海馬GLUR1蛋白含量降低,但并無顯著性差異(P=0.063);CUMS+假針刺組與CUMS模型+針刺+AMPA受體阻斷劑預處理組兩兩比較,大鼠海馬 GLUR1蛋白含量明顯增加,但是并無顯著性差異(P=0.084);CUMS+針刺組與CUMS模型+針刺+AMPA受體阻斷劑預處理組兩兩比較,大鼠海馬GLUR1蛋白含量明顯增加,并且有顯著差異(P=0.001)與空白組比較,CUMS模型組和CUMS+針刺+AMPA阻斷劑預處理組大鼠海馬GLUR2蛋白含量均明顯降低,分別比較均有顯著性差異(P=0.000,P=0.000);與空白組比較,CUMS+針刺組和CUMS+假針刺組大鼠海馬GLUR2蛋白含量降低,分別比較無顯著性差異(P=0.671,P=0.087);與CUMS模型組比較,CUMS+針刺組和CUMS+假針刺組大鼠海馬GLUR2蛋白含量均增加,且有顯著性差異(P=0.000,P=0.02);與CUMS模型組比較,CUMS模型+針刺+AMPA受體阻斷劑預處理組大鼠海馬GLUR2蛋白含量均增加,但是兩兩比較無顯著性差異(P=0.382);CUMS+假針刺組與CUMS模型+針刺組兩兩比較,CUMS+假針刺組大鼠海馬GLUR1蛋白含量降低,但并無顯著性差異(P=0.189);CUMS+針刺組與CUMS模型+針刺+AMPA受體阻斷劑預處理組兩兩比較,大鼠海馬GLUR2蛋白含量明顯增加,并且有顯著差異(P=0.001);CUMS+假針刺組與CUMS模型+針刺+AMPA受體阻斷劑預處理組兩兩比較,大鼠海馬GLUR2蛋白含量降低,有顯著性差異(P=0.016)。從免疫熒光雙標實驗結(jié)果可見:GluR1受體亞基在空白組和CUMS+針刺組中高表達,而GluR2受體亞基在CUMS+針刺組及假針刺組高表達,GluR1受體亞基和GluR2受體亞基在CUMS模型組和CUMS模型+針刺+阻斷劑預處理組中均未見高表達。結(jié)論本研究通過上述兩個實驗佐證證明:(1)針刺能很好的調(diào)節(jié)慢性不可預見性溫和刺激聯(lián)合孤養(yǎng)模型抑郁癥大鼠行為學改變。(2)針刺能增強慢性不可預見性溫和刺激聯(lián)合孤養(yǎng)模型大鼠海馬突觸相關(guān)蛋白GLUR1、p-GLUR1、GLUR2、p-GLUR2、Stargazin、p-Camk Ⅱ、Pick1、PSD95的表達。(3)針刺能增強慢性不可預見性溫和刺激聯(lián)合孤養(yǎng)模型大鼠海馬AMPA受體亞基GluR1和GluR2的表達。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：廣州中醫(yī)藥大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R245

【參考文獻】

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本文編號：1400580