發(fā)布時間：2018-01-09 22:24

  本文關鍵詞：AXL在非小細胞肺癌中的作用及與EGFR信號通路相關性研究　出處：《河北醫(yī)科大學》2017年博士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：在我國以及世界范圍內,肺癌的發(fā)病率及死亡率均位于常見惡性腫瘤的前列。非小細胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC)為肺癌最常見的組織學類型,主要包括鱗癌和腺癌。近年來,表皮生長因子受體(Epidermal Growth Factor Receptor,EGFR)酪氨酸激酶抑制劑(Tyrosine Kinase Inhibitor,TKI)在特定位點突變NSCLC治療中的療效值得肯定,但隨之出現(xiàn)的耐藥問題已經成為NSCLC分子靶向治療的嚴峻挑戰(zhàn)。針對EGFR-TKI治療的耐藥機制包括原發(fā)耐藥和繼發(fā)耐藥兩種,揭示相關耐藥機制對于肺癌患者的有效治療是十分必要和迫切的問題。AXL屬于受體酪氨酸激酶(RTKs)家族,又稱TAM家族,主要包括AXL、Tyro3(Sky)和Mer。從第一次在慢性粒細胞白血病患者中分離獲得后,AXL已被發(fā)現(xiàn)在人類多種細胞中呈現(xiàn)過表達。近來,在多種類型的腫瘤研究中,AXL被視為調節(jié)常規(guī)治療和腫瘤靶向治療耐藥的研究焦點。在NSCLC的治療中,有研究通過對EGFR-TKI產生繼發(fā)耐藥患者腫瘤組織的二次活檢,發(fā)現(xiàn)AXL高表達為第二大耐藥分子標記。此外,AXL基礎表達也與EGFR野生型NSCLC細胞對EGFR-TKI的原發(fā)耐藥有關。因此,深入了解AXL在NSCLC對EGFR-TKI繼發(fā)及原發(fā)耐藥中的作用機制具有重要臨床意義。然而,NSCLC組織中AXL和EGFR兩個受體激酶之間表達的相關性、以及AXL表達與EGFR突變狀態(tài)的關系、抑制AXL表達能否提高NSCLC細胞(EGFR野生型)對藥物的敏感性等問題,目前尚不清楚。鑒于此,本研究第一部分利用肺腺癌患者手術切除石蠟組織作為研究對象,通過檢測組織中EGFR突變(19外顯子缺失及21外顯子L858R)、AXL、EGFR、pEGFR1068蛋白表達,分析AXL與EGFR通路在原發(fā)肺腺癌組織中的相關性;第二部分以NSCLC細胞株—A549及H1299為研究對象,從細胞增殖、細胞周期及凋亡、細胞遷移能力等方面,檢測AXL在細胞中的生物學作用,同時觀察AXL對EGFR下游信號通路AKT及ERK的影響。第三部分進一步探討AXL在A549及H1299細胞對化療及靶向治療藥物反應中的作用。第一部分膜受體激酶AXL與EGFR通路在原發(fā)肺腺癌組織中表達的相關分析目的:檢測EGFR基因19外顯子缺失、21外顯子L858R點突變及20外顯子T790M在肺腺癌組織中的突變情況;檢測AXL、EGFR、pEGFR1068蛋白在肺腺癌組織中的表達及與臨床病理特征的相關性;進一步分析AXL與EGFR、pEGFR1068在EGFR突變及野生型病例中的共表達情況。方法:1.病例信息共收集術前未經放療或化療的原發(fā)肺腺癌患者手術切除標本109例,標本經10%中性福爾馬林固定液固定,石蠟包埋切片備用。2.基因組DNA提取應用TIANamp FFPE DNA試劑盒,按照試劑盒說明提取109例石蠟切片組織中的基因組DNA。3 PCR結合測序方法檢測EGFR19和21外顯子突變采用巢式PCR方法擴增EGFR 19、21外顯子,產物經ABI 3730XL DNA分析儀進行Sanger序列分析。本部分由Invitrogen公司提供服務(合同號MB140120001B)。4 ARMS PCR(amplification refractory mutation specific PCR)采用人類EGFR基因突變檢測試劑盒(ADx-EG10,Amoy Diagnostics Co.,LTD,China)對109例肺癌組織EGFR突變進行檢測。共檢測EGFR基因4種突變,包括:Ex19-mutant-1:E746_A750del(2235-2249 del15)、Ex19-mutant-2:E746_A750del(2236-2250 del15)、Ex21-mutant-1:L858R(2573TG)以及Ex20-mutant-1:T790M(2369CT)。5.免疫組織化學方法采用免疫組織化學染色方法,檢測109例肺腺癌患者腫瘤組織石蠟包埋切片中AXL、EGFR和pEGFR1068的表達情況,并分析其表達與臨床病理特征的關系。6.統(tǒng)計分析應用卡方檢驗檢驗肺腺癌組織中AXL、EGFR和pEGFR1068表達及與臨床病理特征的相關性。應用Spearman相關分析方法評估突變組與野生組之間的關系。結果:1 109例人肺腺癌病例中EGFR突變檢測1.1 PCR結合直接測序法109例病例中,19外顯子缺失病例為25例(22.9%),E746-A750del是最常見的類型(13/25,52.0%)。21外顯子L858R點突變陽性者為22例(20.2%)。綜上,PCR直接測序法共檢測到19Del或21 L858R陽性者47例,陰性62例,總體突變率為43.1%(47/109)。1.2 ARMS方法為了避免出現(xiàn)假陰性結果,進一步利用ARMS方法對PCR-直接測序檢測為陰性的62例進行檢測。結果表明,有21例(33.9%)為EGFR突變陽性。綜合PCR直接測序結果和ARMS檢測結果,109例肺腺癌患者中攜帶EGFR19del、21 L858R常見突變的發(fā)生率為62.4%(68/109)。此外,在109例病例中只有2例(1.83%)出現(xiàn)T790M突變。2 AXL、EGFR和pEGFR1068在人肺腺癌中的表達及與臨床病理特征的相關分析:2.1 AXL蛋白表達免疫組化檢測結果表明,109例肺腺癌組織中,AXL蛋白的陽性表達率為55.0%(60/109),其表達與淋巴轉移顯著相關(P=0.035),但AXL表達與患者年齡、性別、腫瘤大小、TNM分期、腺癌亞型等均無相關性。2.2 EGFR蛋白表達109例肺腺癌組織中EGFR蛋白的陽性表達率為62.4%(68/109),結合患者臨床病理特征分析發(fā)現(xiàn),EGFR表達與腺癌亞型(P=0.02)、腫瘤大小(P0.001)、以及遠處轉移(P=0.007)相關,而與患者年齡、性別、TNM分期等無顯著相關性。2.3 pEGFR1068表達109例肺腺癌組織中pEGFR1068蛋白的陽性表達率為52.3%(57/109)。在腫瘤直徑3cm的病例中,pEGFR1068表達量明顯高于直徑≤3cm者(P0.001);在淋巴結轉移組病例中,pEGFR1068表達量明顯高于無淋巴結轉移組(P0.001)。3 AXL、EGFR/pEGFR1068表達與EGFR19 del和(或)L858R突變狀態(tài)的相關性:109例患者中,單獨出現(xiàn)EGFR19 del突變者共32例,19 del陰性者77例;單獨出現(xiàn)L858R突變者共34例,L858R突變陰性者75例;表現(xiàn)為19 del或L858R突變者共68例,陰性者41例。3.1 AXL表達與突變的相關性:統(tǒng)計分析表明,AXL表達與單獨攜帶19 del突變無統(tǒng)計意義(P=0.05),AXL表達與單獨L858R突變、19 del/L858R突變狀態(tài)無相關性(P0.05)。3.2 EGFR蛋白表達與突變的相關性:在單獨攜帶L858R突變的病例中EGFR蛋白表達率(76.5%,26/34)顯著高于L858R陰性組(56.0%,42/75;P=0.04)。EGFR蛋白表達與單獨19 del、19 del/L858R突變狀態(tài)無相關性。3.3 pEGFR1068表達與突變的相關性:在34例單獨攜帶L858R突變的病例中,pEGFR1068的陽性表達率為73.5%(25/34),顯著高于L858R陰性病例(42.7%,P=0.003)。在68例19 Del/L858R突變者中,pEGFR1068的陽性表達率顯著高于突變陰性組(60.3%v.s.14.6%,P=0.031)。4 AXL與EGFR/pEGFR1068共表達情況檢測去除2例T790M突變病例,在剩余的107例肺腺癌患者中,37例顯示AXL和EGFR共表達,30例患者顯示AXL和pEGFR1068共表達,25例患者顯示AXL,EGFR和pEGFR1068共表達。進一步分析表明AXL+/EGFR+/pEGFR1068共表達百分率在EGFR突變患者顯著高于EGFR野生型患者(30.9%vs.10.3%,P=0.015)。小結:1 109例肺腺癌病例中EGFR 19外顯子缺失突變、21外顯子L858R突變的發(fā)生率較高,達到62.4%,而20外顯子T790M原發(fā)突變僅為1.83%。2 AXL蛋白表達在淋巴結轉移組病例中顯著高于無淋巴結轉移組;EGFR蛋白表達與腺癌亞型、腫瘤大小及遠處轉移相關;pEGFR1068蛋白表達與腫瘤大小及淋巴結轉移顯著相關。3 AXL表達與EGFR突變狀態(tài)間無顯著相關性;EGFR、pEGFR1068表達與EGFR21外顯子L858R點突變顯著相關,而且pEGFR1068在攜帶19 Del或L858R突變患者表達顯著增加,提示EGFR Tyr-1068位點磷酸化與EGFR敏感突變有關。4 AXL+/EGFR+/pEGFR1068共表達率在EGFR突變組顯著高于野生型肺腺癌患者。結果提示,對于AXL與EGFR信號通路共同激活的病例,聯(lián)合應用AXL抑制劑與EGFR抑制劑,將有利于改善對EGFR靶向治療的原發(fā)或繼發(fā)耐藥作用。第二部分AXL在非小細胞肺癌細胞中生物學效應的體外實驗研究目的:本研究以非小細胞肺癌A549、H1299細胞株為模型,利用siRNA干擾技術及AXL激酶抑制劑R428抑制AXL表達及活性,從細胞增殖、細胞周期與凋亡、細胞遷移能力、以及相關信號通路等方面,探討AXL在肺癌中的生物學效應,同時初步觀察抑制AXL表達對EGFR信號通路下游分子ERK/p-ERK、AKT/p-AKT表達的可能作用。方法:1細胞培養(yǎng)及處理人NSCLC細胞株-A549及H1299,培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 U/m L青霉素、100 U/m L鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基,37℃、5%CO2培養(yǎng),細胞貼壁生長,常規(guī)傳代。2 R428處理細胞按2×104/m L密度接種細胞于96孔板中,貼壁后更換含1%血清的RPMI-1640培養(yǎng)基饑餓細胞24h后,加入不同濃度梯度的R428作用24h,計算半數抑制濃度(IC50)值。3 siRNA細胞轉染用100 pmol Negtive control siRNA(NC siRNA)、AXL特異性siRNA轉染H1299和A549細胞,收集細胞用于后續(xù)實驗。4 MTT檢測2×104個/孔細胞均勻接種于96孔板中,貼壁12小時后轉染細胞或給予R428處理,MTT比色法計算細胞存活率。5 Real-time PCR提取細胞總RNA,應用Real-time PCR方法,檢測細胞中AXL m RNA表達。參照Applied Biosystems公司提供的Comparative Ct(ΔΔCt)方法計算目的基因的相對表達量。6蛋白免疫印跡(Western blot)轉染至48小時前兩小時加入或不加EGF刺激2小時,提取細胞總蛋白,采用蛋白免疫印跡方法檢測細胞中AXL、EGFR/pEGFR、ERK/p-ERK、AKT/p-AKT在蛋白水平的表達情況。7 FCM檢測細胞周期分布分別收集NC siRNA或AXL siRNA轉染組細胞、對照組與R428處理組細胞,0.25%胰蛋白酶消化吹打制備單細胞懸液,70%乙醇4℃固定過夜。PI避光染色30min,1h內上機檢測,應用Flow Jo 7.6軟件進行數據分析。每組實驗重復三次。8 FCM檢測細胞凋亡分別收集NC siRNA或AXL siRNA轉染組細胞、對照組與R428處理組細胞,采用Annexin-V/PI試劑盒,通過流式細胞儀檢測各組細胞在A或D狀態(tài)下的凋亡情況,應用Flow Jo 7.6軟件進行數據分析。9 Transwell小室實驗各組細胞以2×104個接種于小室上層,于接種后不同時間,固定染色后于顯微鏡下觀察下室細胞的遷移情況。倒置顯微鏡下任取10個視野,計數穿膜細胞的平均值。每組實驗重復三次。10細胞劃痕實驗分別于劃痕后0-48h觀察各組細胞在劃線兩側的生長情況,于顯微鏡下觀察并拍照,每組實驗重復三次。11統(tǒng)計分析應用SPSS Statistics19.0軟件,數據分析采用兩樣本t檢驗、χ2檢驗、及直線擬合;計量資料以均數±標準差(x±SD)表示。P0.05認為差異具有統(tǒng)計學意義。結果:1 AXL siRNA干擾對A549和H1299細胞的生物學作用1.1 AXL siRNA干擾效率檢測A549和H1299細胞轉染AXL siRNA后,Western Blot和q PCR檢測結果表明,三個siRNA序列均可顯著抑制AXL在蛋白和m RNA水平的表達,我們選擇了其中的一個siRNA1(AXL siRNA)進行后續(xù)實驗。1.2 AXL siRNA干擾對細胞生長的影響與陰性對照組相比,AXL siRNA轉染抑制AXL表達可顯著降低A549細胞和H1299細胞的存活率(P0.05)。1.3 AXL siRNA干擾對細胞周期的影響A549細胞AXL siRNA轉染組G0/G1期比例為(86.10±0.10)%,顯著高于陰性對照組(74.15±0.25)%。而S期、G2M期細胞比例則顯著低于對照組(P0.05)。但siRNA轉染敲低AXL表達對H1299細胞周期無明顯改變。1.4 AXL siRNA轉染對細胞凋亡的影響與陰性對照組相比,AXL siRNA轉染組A549細胞總凋亡率有所增加,但無統(tǒng)計學意義。H1299細胞AXL siRNA轉染后細胞凋亡率顯著高于對照組(P0.05)。1.5 AXL siRNA轉染對細胞遷移能力的影響Transwell小室檢測結果表明,在AXL siRNA轉染的A549細胞和H1299細胞組穿過膜的細胞數目明顯低于各自的對照組(P0.05)。此外,細胞劃痕實驗結果表明,劃痕后48h可見:AXL siRNA轉染組A549細胞劃痕愈合面積(27.43±0.01%)明顯低于對照組(85.67±0.02%),差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。同樣,在AXL siRNA轉染的H1299細胞組細胞朝向劃痕的愈合面積明顯低于對照組細胞(P0.05)。綜合上述結果表明,抑制AXL表達可降低A549細胞、H1299細胞的遷移能力。2特異性AXL激酶抑制劑—R428對A549和H1299細胞的生物學作用2.1 R428對細胞生長的影響MTT結果表明,隨R428處理濃度增加,兩種細胞存活率逐漸降低。經統(tǒng)計分析表明,A549、H1299細胞中R428的IC50值分別為28.98n M、34.71n M。后續(xù)實驗我們選擇R428的使用濃度為20n M。2.2 R428對細胞周期的影響20n M R428作用24小時,與對照組相比,R428處理組A549細胞G0/G1期比例顯著增加(R428:(88.37±0.15)%;對照組:(68.60±0.20)%),而S期、G2/M細胞比例顯著降低(P0.05)。此外,R428處理組H1299細胞周期分布變化與A549變化一致。結果表明20n M R428處理可引起A549和H1299細胞G0/G1期阻滯。2.3 R428對細胞凋亡的影響與對照組相比,R428處理組A549細胞總凋亡率無明顯改變,但是20n M R428處理可引起H1299細胞凋亡率明顯增高(P0.05)。2.4 R428對細胞遷移能力的影響Transwell小室檢測結果表明,R428處理可顯著抑制A549細胞和H1299細胞穿過膜的細胞數目(P0.05)。劃痕48h實驗結果顯示,R428處理組A549細胞劃痕愈合面積(15.78±0.01%)明顯低于對照組(92.45±0.10%),差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。此外,R428處理組H1299細胞劃痕愈合面積顯著低于對照組。3抑制AXL表達對細胞ERK/p-ERK、AKT/p-AKT水平的影響細胞分為4組:NC siRNA、AXL siRNA、NC siRNA+EGF、AXL siRNA+EGF組。蛋白印跡結果表明,AXL siRNA轉染組A549細胞、H1299細胞中p-AKT的水平顯著低于對照組,但是EGFR、p-EGFR、ERK、p-ERK的水平變化不明顯。給予細胞EGFR受體的配體—EGF刺激后,細胞中p-EGFR水平顯著增高,證實EGFR通路被激活。同時EGFR下游p-ERK及p-AKT的水平也不同程度升高。但與EGF+NC siRNA處理組相比,AXL siRNA轉染聯(lián)合EGF刺激后,兩種細胞中p-AKT的水平顯著被抑制。結果提示:AXL表達對EGFR下游通路p-AKT的活化具有一定的激活作用,AXL與EGFR通路間存在一定的交叉作用。小結:1 轉染AXL siRNA敲低A549、H1299細胞中AXL在m RNA及蛋白水平表達,可顯著抑制兩種細胞的增殖活性,其機制與細胞發(fā)生G0/G1期阻滯或促進細胞凋亡有關。2 20n M AXL激酶抑制劑-R428處理A549、H1299細胞,可引起兩種細胞發(fā)生G0/G1期阻滯,顯著抑制細胞的增殖活性。3 AXL siRNA轉染或R428處理可顯著抑制A549細胞及H1299細胞遷移能力。4 轉染AXL siRNA敲低AXL表達,可顯著抑制A549及H1299細胞中p-AKT的水平。p-AKT作為AXL與EGFR共同的下游信號分子,AXL對p-AKT的調節(jié)可能是AXL激酶與EGFR下游通路的交叉點。第三部分AXL在NSCLC細胞對gefitinib及docetaxel藥物反應中的作用目的:通過siRNA干擾技術敲低A549及H1299細胞中AXL表達,或給予AXL激酶抑制劑—R428抑制其激酶活性,觀察細胞對gefitinib及docetaxel反應性的影響。此外,從細胞周期分布及細胞凋亡兩方面,初步分析AXL在細胞對藥物反應中的可能作用機制。方法:1細胞培養(yǎng)及轉染人NSCLC細胞株A549及H1299細胞株,培養(yǎng)條件及siRNA轉染條件同第二部分。2 siRNA細胞轉染聯(lián)合藥物處理細胞及分組2.1轉染聯(lián)合gefitinib將細胞分為Negative control siRNA(NC組)、AXL siRNA、NC+gefitinib、AXLsiRNA+gefitinib四組。按照上述方法培養(yǎng)并轉染細胞,轉染后24小時加入gefitinib使終濃度為10n M,繼續(xù)作用24小時收取細胞進行相關實驗。2.2轉染聯(lián)合Docetaxel將細胞分為Negative control siRNA(NC組)、AXL siRNA、NC+Docetaxel、AXLsiRNA+Docetaxel四組。按照上述方法培養(yǎng)并轉染細胞,轉染后24小時加入Docetaxel使終濃度為20n M,繼續(xù)作用24小時收取細胞進行相關實驗。3 R428聯(lián)合藥物處理細胞及分組3.1 R428聯(lián)合gefitinib將細胞分為對照組、R428處理組、gefitinib(10n M)、R428聯(lián)合gefitinib四組。按2×104/m L密度將細胞均勻接種于6孔板中,貼壁后換成含1%血清的RPMI 1640培養(yǎng)基饑餓細胞24h后,加入R428和或gefitinib作用24h收集各組細胞進行后續(xù)檢測。3.2 R428聯(lián)合Docetaxel將細胞分為對照組、R428處理組、docetaxel(20n M)、R428聯(lián)合docetaxel(20n M)四組。按2×104/m L密度將細胞均勻接種于6孔板中,貼壁后換成含1%血清的RPMI 1640培養(yǎng)基饑餓細胞24h后,加入R428和或docetaxel作用24h收集各組細胞進行后續(xù)檢測。4 MTT檢測2×104個/孔細胞均勻接種于96孔板中,貼壁12小時后,按上述分組經不同處理措施后,MTT比色法計算細胞存活率。5 FCM檢測細胞周期分布分別收集不同處理組細胞,備單細胞懸液,70%乙醇4℃固定過夜。PI避光染色30min,1h內上機檢測,應用Flow Jo 7.6軟件進行數據分析。每組實驗重復三次。6 FCM檢測細胞凋亡分別收集不同處理組細胞,采用Annexin-V/PI試劑盒,通過流式細胞儀檢測各組細胞在A或D狀態(tài)下的凋亡情況,應用Flow Jo 7.6軟件進行數據分析。7統(tǒng)計分析所有數據應用SPSS Statistics19.0軟件,數據分析采用方差分析或T檢驗;計量資料以均數±標準差(x±SD)表示。P0.05認為差異具有統(tǒng)計學意義。結果:1 AXL siRNA干擾聯(lián)合gefitinib對A549與H1299細胞生長的影響及機制探討1.1 MTT檢測在A549與H1299細胞中,與NC組相比,AXL siRNA干擾組、NC+gefitinib組及AXL siRNA+gefitinib組細胞存活率均顯著降低(P0.05)。與AXL siRNA干擾組、NC+gefitinib組相比,AXL siRNA+gefitinib組細胞存活率顯著降低(P0.05)。1.2 FCM檢測細胞周期分布在A549與H1299細胞中,與NC組相比,僅AXL siRNA+gefitinib組細胞G0/G1期比例顯著增多,而G2/M期以及S期細胞比例顯著減少(P0.05);NC+gefitinib處理對細胞周期無顯著影響。組間比較:AXL siRNA+gefitinib組細胞G0/G1期比例雖顯著高于NC+gefitinib組(P0.05)。1.3 FCM檢測細胞凋亡在A549與H1299細胞中,與NC組相比,NC+gefitinib組及AXL siRNA+gefitinib組細胞凋亡率均顯著升高(P0.05)。組間比較,AXL siRNA+gefitinib組細胞凋亡率顯著高于AXL siRNA組及NC+gefitinib組(P0.05)。2.R428聯(lián)合gefitinib對A549與H1299細胞生長的影響及機制探討2.1 MTT檢測在A549與H1299細胞中,與對照組相比,R428處理組、gefitinib組以及R428聯(lián)合gefitinib組細胞存活率均明顯被抑制(P0.05)。組間比較:R428聯(lián)合gefitinib組細胞存活率最低,明顯低于gefitinib組和R428干預組(P0.05)。2.2 FCM檢測細胞周期分布在A549與H1299細胞中,與對照組相比,R428處理組、R428聯(lián)合gefitinib組細胞G0/G1期比例顯著增多,G2/M期、S其細胞比例相應減少(P0.05)。組間比較:R428聯(lián)合gefitinib組細胞G0/G1期比例雖顯著高于gefitinib組(P0.05)。2.3 FCM檢測細胞凋亡在A549與H1299細胞中,與對照組相比,gefitinib處理組、R428聯(lián)合gefitinib組細胞凋亡率顯著增加(P0.05)。組間比較:R428聯(lián)合gefitinib處理組細胞凋亡率較R428處理組、gefitinib處理組均顯著增加(P0.05)。3.AXL siRNA干擾聯(lián)合Docetaxel對A549和H1299細胞生長的影響及機制探討:3.1 MTT檢測在A549與H1299細胞中,與NC相比,AXL siRNA干擾組、NC+docetaxel組及AXL siRNA+docetaxel組細胞存活率均出現(xiàn)不同程度降低(P0.05)。組間比較:在A549細胞中AXL siRNA+docetaxel組細胞存活率低于NC+docetaxel組與AXL siRNA干擾組(P0.05)。在H1299細胞中,聯(lián)合用藥組與單獨處理組均無顯著差異。3.2 FCM檢測細胞周期分布在A549與H1299細胞中,與NC組相比,NC+docetaxel組細胞處于G2/M期比例顯著增加G0/G1期細胞比例則顯著降低提示docetaxel可引起細胞發(fā)生G2/M期周期阻滯。組間比較:與NC+docetaxel相比,在A549細胞中AXL siRNA+docetaxel處理組細胞G2/M期比例顯著降低,而G0/G1期細胞則顯著增加(P0.05)。在H1299細胞中,NC+docetaxel與AXL siRNA+docetaxel組相比,各期細胞比例無顯著差異(P0.05)。3.3 FCM檢測細胞凋亡在A549與H1299細胞中,與NC組相比,NC+docetaxel組及AXL siRNA+docetaxel組細胞凋亡率均顯著升高(P0.05)。組間比較:AXL siRNA+docetaxel組細胞凋亡率顯著高于AXL siRNA組(P0.05)。4 R428聯(lián)合docetaxel對A549和H1299細胞生長的影響及機制探討:4.1 MTT檢測:在A549和H1299細胞中,與對照組相比,R428處理組、docetaxel處理組、R428聯(lián)合docetaxel處理組細胞活存率均降低(P0.05)。組間比較:R428聯(lián)合docetaxel組細胞存活率最低,顯著低于docetaxel組和R428處理組(P0.05)。4.2 FCM檢測細胞周期分布在A549和H1299細胞中,與對照組相比,docetaxel處理組細胞處于G2/M期比例顯著增加G0/G1期細胞比例則顯著降低(P0.05);R428處理組細胞G0/G1期比例顯著增多,G2/M期、S期細胞比例相應減少(P0.05)。組間比較:與單獨docetaxel組相比,R428聯(lián)合docetaxel處理組細胞G2/M期比例顯著降低,而G0/G1期細胞則相應顯著增加(P0.05)。4.3 FCM檢測細胞凋亡在A549和H1299細胞中,與對照組相比,docetaxel組及R428聯(lián)合docetaxel處理組細胞凋亡率均顯著升高(P0.05)。組間比較:R428聯(lián)合docetaxel處理組細胞凋亡率顯著高于R428處理組(P0.05)。小結:1 Gefitinib處理A549與H1299細胞,對細胞周期影響不顯著,但可促進細胞凋亡,從而抑制細胞的增殖活性。2 Docetaxel處理A549與H1299細胞,可引起明顯的G2/M期周期阻滯,發(fā)揮其對細胞生長的抑制作用。3 AXL siRNA轉染/R428聯(lián)合gefitinib處理,對A549與H1299細胞生長的抑制作用高于單獨處理組,其對生長的抑制與引起細胞G0/G1阻滯或促進凋亡相關。4 R428聯(lián)合docetaxel處理對A549與H1299細胞生長的抑制作用高于單獨處理組,其抑制作用與引起細胞G0/G1、G2/M期細胞周期阻滯或促進凋亡相關。結論:1 109例肺腺癌組織中,EGFR 19外顯子缺失突變、21外顯子L858R突變的發(fā)生率較高(62.4%),而20外顯子T790M原發(fā)突變僅為1.83%。2 109例肺腺癌病例中,AXL蛋白表達在淋巴結轉移組病例中顯著高于無淋巴結轉移組;EGFR蛋白表達與腺癌亞型、腫瘤大小及遠處轉移相關;pEGFR1068蛋白表達與腫瘤大小及淋巴結轉移顯著相關。3 AXL表達與EGFR突變狀態(tài)間無顯著相關性;EGFR、pEGFR1068表達與EGFR21外顯子L858R點突變顯著相關,而且pEGFR1068在攜帶19 Del或L858R突變患者表達顯著增加,提示EGFR Tyr-1068位點磷酸化與EGFR敏感突變有關。4 AXL+/EGFR+/pEGFR1068共表達率在EGFR突變組顯著高于野生型肺腺癌患者,表明在部分原發(fā)肺腺癌病例中AXL與EGFR通路間存在共表達情況。體外實驗進一步表明,p-AKT作為AXL與EGFR共同的下游信號分子,AXL對p-AKT的調節(jié)可能是AXL激酶與EGFR下游通路的交叉點之一。5 轉染AXL siRNA或給予20n M AXL激酶抑制劑-R428處理A549與H1299細胞,可顯著抑制細胞的增殖活性,其機制與細胞發(fā)生G0/G1期阻滯或促進細胞凋亡有關。同時,抑制AXL可顯著降低細胞的遷移能力。6 Gefitinib或docetaxel單獨處理A549與H1299細胞,可顯著抑制細胞的生長。其中gefitinib可促進細胞凋亡從而抑制細胞的增殖活性,而docetaxel可引起明顯的G2/M期周期阻滯,發(fā)揮其對細胞生長的抑制作用。7 AXL siRNA轉染/R428聯(lián)合gefitinib或docetaxel處理,對A549與H1299細胞生長的抑制作用高于單獨處理組,其對生長的抑制與引起細胞G0/G1、G2/M阻滯或促進凋亡相關。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R734.2

【參考文獻】

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1 符江琳;劉承云;徐曉;劉存飛;陳星霖;;Gas6經PI3K/Akt通路對缺氧復氧誘導H9c2細胞凋亡的影響[J];中國病理生理雜志;2011年08期

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本文編號：1402779