發(fā)布時(shí)間：2018-01-09 22:24

  本文關(guān)鍵詞：AXL在非小細(xì)胞肺癌中的作用及與EGFR信號(hào)通路相關(guān)性研究　出處：《河北醫(yī)科大學(xué)》2017年博士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

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【摘要】：在我國(guó)以及世界范圍內(nèi),肺癌的發(fā)病率及死亡率均位于常見(jiàn)惡性腫瘤的前列。非小細(xì)胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC)為肺癌最常見(jiàn)的組織學(xué)類(lèi)型,主要包括鱗癌和腺癌。近年來(lái),表皮生長(zhǎng)因子受體(Epidermal Growth Factor Receptor,EGFR)酪氨酸激酶抑制劑(Tyrosine Kinase Inhibitor,TKI)在特定位點(diǎn)突變NSCLC治療中的療效值得肯定,但隨之出現(xiàn)的耐藥問(wèn)題已經(jīng)成為NSCLC分子靶向治療的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。針對(duì)EGFR-TKI治療的耐藥機(jī)制包括原發(fā)耐藥和繼發(fā)耐藥兩種,揭示相關(guān)耐藥機(jī)制對(duì)于肺癌患者的有效治療是十分必要和迫切的問(wèn)題。AXL屬于受體酪氨酸激酶(RTKs)家族,又稱TAM家族,主要包括AXL、Tyro3(Sky)和Mer。從第一次在慢性粒細(xì)胞白血病患者中分離獲得后,AXL已被發(fā)現(xiàn)在人類(lèi)多種細(xì)胞中呈現(xiàn)過(guò)表達(dá)。近來(lái),在多種類(lèi)型的腫瘤研究中,AXL被視為調(diào)節(jié)常規(guī)治療和腫瘤靶向治療耐藥的研究焦點(diǎn)。在NSCLC的治療中,有研究通過(guò)對(duì)EGFR-TKI產(chǎn)生繼發(fā)耐藥患者腫瘤組織的二次活檢,發(fā)現(xiàn)AXL高表達(dá)為第二大耐藥分子標(biāo)記。此外,AXL基礎(chǔ)表達(dá)也與EGFR野生型NSCLC細(xì)胞對(duì)EGFR-TKI的原發(fā)耐藥有關(guān)。因此,深入了解AXL在NSCLC對(duì)EGFR-TKI繼發(fā)及原發(fā)耐藥中的作用機(jī)制具有重要臨床意義。然而,NSCLC組織中AXL和EGFR兩個(gè)受體激酶之間表達(dá)的相關(guān)性、以及AXL表達(dá)與EGFR突變狀態(tài)的關(guān)系、抑制AXL表達(dá)能否提高NSCLC細(xì)胞(EGFR野生型)對(duì)藥物的敏感性等問(wèn)題,目前尚不清楚。鑒于此,本研究第一部分利用肺腺癌患者手術(shù)切除石蠟組織作為研究對(duì)象,通過(guò)檢測(cè)組織中EGFR突變(19外顯子缺失及21外顯子L858R)、AXL、EGFR、pEGFR1068蛋白表達(dá),分析AXL與EGFR通路在原發(fā)肺腺癌組織中的相關(guān)性;第二部分以NSCLC細(xì)胞株—A549及H1299為研究對(duì)象,從細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期及凋亡、細(xì)胞遷移能力等方面,檢測(cè)AXL在細(xì)胞中的生物學(xué)作用,同時(shí)觀察AXL對(duì)EGFR下游信號(hào)通路AKT及ERK的影響。第三部分進(jìn)一步探討AXL在A549及H1299細(xì)胞對(duì)化療及靶向治療藥物反應(yīng)中的作用。第一部分膜受體激酶AXL與EGFR通路在原發(fā)肺腺癌組織中表達(dá)的相關(guān)分析目的:檢測(cè)EGFR基因19外顯子缺失、21外顯子L858R點(diǎn)突變及20外顯子T790M在肺腺癌組織中的突變情況;檢測(cè)AXL、EGFR、pEGFR1068蛋白在肺腺癌組織中的表達(dá)及與臨床病理特征的相關(guān)性;進(jìn)一步分析AXL與EGFR、pEGFR1068在EGFR突變及野生型病例中的共表達(dá)情況。方法:1.病例信息共收集術(shù)前未經(jīng)放療或化療的原發(fā)肺腺癌患者手術(shù)切除標(biāo)本109例,標(biāo)本經(jīng)10%中性福爾馬林固定液固定,石蠟包埋切片備用。2.基因組DNA提取應(yīng)用TIANamp FFPE DNA試劑盒,按照試劑盒說(shuō)明提取109例石蠟切片組織中的基因組DNA。3 PCR結(jié)合測(cè)序方法檢測(cè)EGFR19和21外顯子突變采用巢式PCR方法擴(kuò)增EGFR 19、21外顯子,產(chǎn)物經(jīng)ABI 3730XL DNA分析儀進(jìn)行Sanger序列分析。本部分由Invitrogen公司提供服務(wù)(合同號(hào)MB140120001B)。4 ARMS PCR(amplification refractory mutation specific PCR)采用人類(lèi)EGFR基因突變檢測(cè)試劑盒(ADx-EG10,Amoy Diagnostics Co.,LTD,China)對(duì)109例肺癌組織EGFR突變進(jìn)行檢測(cè)。共檢測(cè)EGFR基因4種突變,包括:Ex19-mutant-1:E746_A750del(2235-2249 del15)、Ex19-mutant-2:E746_A750del(2236-2250 del15)、Ex21-mutant-1:L858R(2573TG)以及Ex20-mutant-1:T790M(2369CT)。5.免疫組織化學(xué)方法采用免疫組織化學(xué)染色方法,檢測(cè)109例肺腺癌患者腫瘤組織石蠟包埋切片中AXL、EGFR和pEGFR1068的表達(dá)情況,并分析其表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系。6.統(tǒng)計(jì)分析應(yīng)用卡方檢驗(yàn)檢驗(yàn)肺腺癌組織中AXL、EGFR和pEGFR1068表達(dá)及與臨床病理特征的相關(guān)性。應(yīng)用Spearman相關(guān)分析方法評(píng)估突變組與野生組之間的關(guān)系。結(jié)果:1 109例人肺腺癌病例中EGFR突變檢測(cè)1.1 PCR結(jié)合直接測(cè)序法109例病例中,19外顯子缺失病例為25例(22.9%),E746-A750del是最常見(jiàn)的類(lèi)型(13/25,52.0%)。21外顯子L858R點(diǎn)突變陽(yáng)性者為22例(20.2%)。綜上,PCR直接測(cè)序法共檢測(cè)到19Del或21 L858R陽(yáng)性者47例,陰性62例,總體突變率為43.1%(47/109)。1.2 ARMS方法為了避免出現(xiàn)假陰性結(jié)果,進(jìn)一步利用ARMS方法對(duì)PCR-直接測(cè)序檢測(cè)為陰性的62例進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明,有21例(33.9%)為EGFR突變陽(yáng)性。綜合PCR直接測(cè)序結(jié)果和ARMS檢測(cè)結(jié)果,109例肺腺癌患者中攜帶EGFR19del、21 L858R常見(jiàn)突變的發(fā)生率為62.4%(68/109)。此外,在109例病例中只有2例(1.83%)出現(xiàn)T790M突變。2 AXL、EGFR和pEGFR1068在人肺腺癌中的表達(dá)及與臨床病理特征的相關(guān)分析:2.1 AXL蛋白表達(dá)免疫組化檢測(cè)結(jié)果表明,109例肺腺癌組織中,AXL蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率為55.0%(60/109),其表達(dá)與淋巴轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)(P=0.035),但AXL表達(dá)與患者年齡、性別、腫瘤大小、TNM分期、腺癌亞型等均無(wú)相關(guān)性。2.2 EGFR蛋白表達(dá)109例肺腺癌組織中EGFR蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率為62.4%(68/109),結(jié)合患者臨床病理特征分析發(fā)現(xiàn),EGFR表達(dá)與腺癌亞型(P=0.02)、腫瘤大小(P0.001)、以及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(P=0.007)相關(guān),而與患者年齡、性別、TNM分期等無(wú)顯著相關(guān)性。2.3 pEGFR1068表達(dá)109例肺腺癌組織中pEGFR1068蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率為52.3%(57/109)。在腫瘤直徑3cm的病例中,pEGFR1068表達(dá)量明顯高于直徑≤3cm者(P0.001);在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組病例中,pEGFR1068表達(dá)量明顯高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(P0.001)。3 AXL、EGFR/pEGFR1068表達(dá)與EGFR19 del和(或)L858R突變狀態(tài)的相關(guān)性:109例患者中,單獨(dú)出現(xiàn)EGFR19 del突變者共32例,19 del陰性者77例;單獨(dú)出現(xiàn)L858R突變者共34例,L858R突變陰性者75例;表現(xiàn)為19 del或L858R突變者共68例,陰性者41例。3.1 AXL表達(dá)與突變的相關(guān)性:統(tǒng)計(jì)分析表明,AXL表達(dá)與單獨(dú)攜帶19 del突變無(wú)統(tǒng)計(jì)意義(P=0.05),AXL表達(dá)與單獨(dú)L858R突變、19 del/L858R突變狀態(tài)無(wú)相關(guān)性(P0.05)。3.2 EGFR蛋白表達(dá)與突變的相關(guān)性:在單獨(dú)攜帶L858R突變的病例中EGFR蛋白表達(dá)率(76.5%,26/34)顯著高于L858R陰性組(56.0%,42/75;P=0.04)。EGFR蛋白表達(dá)與單獨(dú)19 del、19 del/L858R突變狀態(tài)無(wú)相關(guān)性。3.3 pEGFR1068表達(dá)與突變的相關(guān)性:在34例單獨(dú)攜帶L858R突變的病例中,pEGFR1068的陽(yáng)性表達(dá)率為73.5%(25/34),顯著高于L858R陰性病例(42.7%,P=0.003)。在68例19 Del/L858R突變者中,pEGFR1068的陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于突變陰性組(60.3%v.s.14.6%,P=0.031)。4 AXL與EGFR/pEGFR1068共表達(dá)情況檢測(cè)去除2例T790M突變病例,在剩余的107例肺腺癌患者中,37例顯示AXL和EGFR共表達(dá),30例患者顯示AXL和pEGFR1068共表達(dá),25例患者顯示AXL,EGFR和pEGFR1068共表達(dá)。進(jìn)一步分析表明AXL+/EGFR+/pEGFR1068共表達(dá)百分率在EGFR突變患者顯著高于EGFR野生型患者(30.9%vs.10.3%,P=0.015)。小結(jié):1 109例肺腺癌病例中EGFR 19外顯子缺失突變、21外顯子L858R突變的發(fā)生率較高,達(dá)到62.4%,而20外顯子T790M原發(fā)突變僅為1.83%。2 AXL蛋白表達(dá)在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組病例中顯著高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組;EGFR蛋白表達(dá)與腺癌亞型、腫瘤大小及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān);pEGFR1068蛋白表達(dá)與腫瘤大小及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)。3 AXL表達(dá)與EGFR突變狀態(tài)間無(wú)顯著相關(guān)性;EGFR、pEGFR1068表達(dá)與EGFR21外顯子L858R點(diǎn)突變顯著相關(guān),而且pEGFR1068在攜帶19 Del或L858R突變患者表達(dá)顯著增加,提示EGFR Tyr-1068位點(diǎn)磷酸化與EGFR敏感突變有關(guān)。4 AXL+/EGFR+/pEGFR1068共表達(dá)率在EGFR突變組顯著高于野生型肺腺癌患者。結(jié)果提示,對(duì)于AXL與EGFR信號(hào)通路共同激活的病例,聯(lián)合應(yīng)用AXL抑制劑與EGFR抑制劑,將有利于改善對(duì)EGFR靶向治療的原發(fā)或繼發(fā)耐藥作用。第二部分AXL在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中生物學(xué)效應(yīng)的體外實(shí)驗(yàn)研究目的:本研究以非小細(xì)胞肺癌A549、H1299細(xì)胞株為模型,利用siRNA干擾技術(shù)及AXL激酶抑制劑R428抑制AXL表達(dá)及活性,從細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期與凋亡、細(xì)胞遷移能力、以及相關(guān)信號(hào)通路等方面,探討AXL在肺癌中的生物學(xué)效應(yīng),同時(shí)初步觀察抑制AXL表達(dá)對(duì)EGFR信號(hào)通路下游分子ERK/p-ERK、AKT/p-AKT表達(dá)的可能作用。方法:1細(xì)胞培養(yǎng)及處理人NSCLC細(xì)胞株-A549及H1299,培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 U/m L青霉素、100 U/m L鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基,37℃、5%CO2培養(yǎng),細(xì)胞貼壁生長(zhǎng),常規(guī)傳代。2 R428處理細(xì)胞按2×104/m L密度接種細(xì)胞于96孔板中,貼壁后更換含1%血清的RPMI-1640培養(yǎng)基饑餓細(xì)胞24h后,加入不同濃度梯度的R428作用24h,計(jì)算半數(shù)抑制濃度(IC50)值。3 siRNA細(xì)胞轉(zhuǎn)染用100 pmol Negtive control siRNA(NC siRNA)、AXL特異性siRNA轉(zhuǎn)染H1299和A549細(xì)胞,收集細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。4 MTT檢測(cè)2×104個(gè)/孔細(xì)胞均勻接種于96孔板中,貼壁12小時(shí)后轉(zhuǎn)染細(xì)胞或給予R428處理,MTT比色法計(jì)算細(xì)胞存活率。5 Real-time PCR提取細(xì)胞總RNA,應(yīng)用Real-time PCR方法,檢測(cè)細(xì)胞中AXL m RNA表達(dá)。參照Applied Biosystems公司提供的Comparative Ct(ΔΔCt)方法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。6蛋白免疫印跡(Western blot)轉(zhuǎn)染至48小時(shí)前兩小時(shí)加入或不加EGF刺激2小時(shí),提取細(xì)胞總蛋白,采用蛋白免疫印跡方法檢測(cè)細(xì)胞中AXL、EGFR/pEGFR、ERK/p-ERK、AKT/p-AKT在蛋白水平的表達(dá)情況。7 FCM檢測(cè)細(xì)胞周期分布分別收集NC siRNA或AXL siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞、對(duì)照組與R428處理組細(xì)胞,0.25%胰蛋白酶消化吹打制備單細(xì)胞懸液,70%乙醇4℃固定過(guò)夜。PI避光染色30min,1h內(nèi)上機(jī)檢測(cè),應(yīng)用Flow Jo 7.6軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。8 FCM檢測(cè)細(xì)胞凋亡分別收集NC siRNA或AXL siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞、對(duì)照組與R428處理組細(xì)胞,采用Annexin-V/PI試劑盒,通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞在A或D狀態(tài)下的凋亡情況,應(yīng)用Flow Jo 7.6軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。9 Transwell小室實(shí)驗(yàn)各組細(xì)胞以2×104個(gè)接種于小室上層,于接種后不同時(shí)間,固定染色后于顯微鏡下觀察下室細(xì)胞的遷移情況。倒置顯微鏡下任取10個(gè)視野,計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞的平均值。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。10細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)分別于劃痕后0-48h觀察各組細(xì)胞在劃線兩側(cè)的生長(zhǎng)情況,于顯微鏡下觀察并拍照,每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。11統(tǒng)計(jì)分析應(yīng)用SPSS Statistics19.0軟件,數(shù)據(jù)分析采用兩樣本t檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)、及直線擬合;計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±SD)表示。P0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果:1 AXL siRNA干擾對(duì)A549和H1299細(xì)胞的生物學(xué)作用1.1 AXL siRNA干擾效率檢測(cè)A549和H1299細(xì)胞轉(zhuǎn)染AXL siRNA后,Western Blot和q PCR檢測(cè)結(jié)果表明,三個(gè)siRNA序列均可顯著抑制AXL在蛋白和m RNA水平的表達(dá),我們選擇了其中的一個(gè)siRNA1(AXL siRNA)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。1.2 AXL siRNA干擾對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響與陰性對(duì)照組相比,AXL siRNA轉(zhuǎn)染抑制AXL表達(dá)可顯著降低A549細(xì)胞和H1299細(xì)胞的存活率(P0.05)。1.3 AXL siRNA干擾對(duì)細(xì)胞周期的影響A549細(xì)胞AXL siRNA轉(zhuǎn)染組G0/G1期比例為(86.10±0.10)%,顯著高于陰性對(duì)照組(74.15±0.25)%。而S期、G2M期細(xì)胞比例則顯著低于對(duì)照組(P0.05)。但siRNA轉(zhuǎn)染敲低AXL表達(dá)對(duì)H1299細(xì)胞周期無(wú)明顯改變。1.4 AXL siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)細(xì)胞凋亡的影響與陰性對(duì)照組相比,AXL siRNA轉(zhuǎn)染組A549細(xì)胞總凋亡率有所增加,但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。H1299細(xì)胞AXL siRNA轉(zhuǎn)染后細(xì)胞凋亡率顯著高于對(duì)照組(P0.05)。1.5 AXL siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)細(xì)胞遷移能力的影響Transwell小室檢測(cè)結(jié)果表明,在AXL siRNA轉(zhuǎn)染的A549細(xì)胞和H1299細(xì)胞組穿過(guò)膜的細(xì)胞數(shù)目明顯低于各自的對(duì)照組(P0.05)。此外,細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,劃痕后48h可見(jiàn):AXL siRNA轉(zhuǎn)染組A549細(xì)胞劃痕愈合面積(27.43±0.01%)明顯低于對(duì)照組(85.67±0.02%),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。同樣,在AXL siRNA轉(zhuǎn)染的H1299細(xì)胞組細(xì)胞朝向劃痕的愈合面積明顯低于對(duì)照組細(xì)胞(P0.05)。綜合上述結(jié)果表明,抑制AXL表達(dá)可降低A549細(xì)胞、H1299細(xì)胞的遷移能力。2特異性AXL激酶抑制劑—R428對(duì)A549和H1299細(xì)胞的生物學(xué)作用2.1 R428對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響MTT結(jié)果表明,隨R428處理濃度增加,兩種細(xì)胞存活率逐漸降低。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析表明,A549、H1299細(xì)胞中R428的IC50值分別為28.98n M、34.71n M。后續(xù)實(shí)驗(yàn)我們選擇R428的使用濃度為20n M。2.2 R428對(duì)細(xì)胞周期的影響20n M R428作用24小時(shí),與對(duì)照組相比,R428處理組A549細(xì)胞G0/G1期比例顯著增加(R428:(88.37±0.15)%;對(duì)照組:(68.60±0.20)%),而S期、G2/M細(xì)胞比例顯著降低(P0.05)。此外,R428處理組H1299細(xì)胞周期分布變化與A549變化一致。結(jié)果表明20n M R428處理可引起A549和H1299細(xì)胞G0/G1期阻滯。2.3 R428對(duì)細(xì)胞凋亡的影響與對(duì)照組相比,R428處理組A549細(xì)胞總凋亡率無(wú)明顯改變,但是20n M R428處理可引起H1299細(xì)胞凋亡率明顯增高(P0.05)。2.4 R428對(duì)細(xì)胞遷移能力的影響Transwell小室檢測(cè)結(jié)果表明,R428處理可顯著抑制A549細(xì)胞和H1299細(xì)胞穿過(guò)膜的細(xì)胞數(shù)目(P0.05)。劃痕48h實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,R428處理組A549細(xì)胞劃痕愈合面積(15.78±0.01%)明顯低于對(duì)照組(92.45±0.10%),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。此外,R428處理組H1299細(xì)胞劃痕愈合面積顯著低于對(duì)照組。3抑制AXL表達(dá)對(duì)細(xì)胞ERK/p-ERK、AKT/p-AKT水平的影響細(xì)胞分為4組:NC siRNA、AXL siRNA、NC siRNA+EGF、AXL siRNA+EGF組。蛋白印跡結(jié)果表明,AXL siRNA轉(zhuǎn)染組A549細(xì)胞、H1299細(xì)胞中p-AKT的水平顯著低于對(duì)照組,但是EGFR、p-EGFR、ERK、p-ERK的水平變化不明顯。給予細(xì)胞EGFR受體的配體—EGF刺激后,細(xì)胞中p-EGFR水平顯著增高,證實(shí)EGFR通路被激活。同時(shí)EGFR下游p-ERK及p-AKT的水平也不同程度升高。但與EGF+NC siRNA處理組相比,AXL siRNA轉(zhuǎn)染聯(lián)合EGF刺激后,兩種細(xì)胞中p-AKT的水平顯著被抑制。結(jié)果提示:AXL表達(dá)對(duì)EGFR下游通路p-AKT的活化具有一定的激活作用,AXL與EGFR通路間存在一定的交叉作用。小結(jié):1 轉(zhuǎn)染AXL siRNA敲低A549、H1299細(xì)胞中AXL在m RNA及蛋白水平表達(dá),可顯著抑制兩種細(xì)胞的增殖活性,其機(jī)制與細(xì)胞發(fā)生G0/G1期阻滯或促進(jìn)細(xì)胞凋亡有關(guān)。2 20n M AXL激酶抑制劑-R428處理A549、H1299細(xì)胞,可引起兩種細(xì)胞發(fā)生G0/G1期阻滯,顯著抑制細(xì)胞的增殖活性。3 AXL siRNA轉(zhuǎn)染或R428處理可顯著抑制A549細(xì)胞及H1299細(xì)胞遷移能力。4 轉(zhuǎn)染AXL siRNA敲低AXL表達(dá),可顯著抑制A549及H1299細(xì)胞中p-AKT的水平。p-AKT作為AXL與EGFR共同的下游信號(hào)分子,AXL對(duì)p-AKT的調(diào)節(jié)可能是AXL激酶與EGFR下游通路的交叉點(diǎn)。第三部分AXL在NSCLC細(xì)胞對(duì)gefitinib及docetaxel藥物反應(yīng)中的作用目的:通過(guò)siRNA干擾技術(shù)敲低A549及H1299細(xì)胞中AXL表達(dá),或給予AXL激酶抑制劑—R428抑制其激酶活性,觀察細(xì)胞對(duì)gefitinib及docetaxel反應(yīng)性的影響。此外,從細(xì)胞周期分布及細(xì)胞凋亡兩方面,初步分析AXL在細(xì)胞對(duì)藥物反應(yīng)中的可能作用機(jī)制。方法:1細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染人NSCLC細(xì)胞株A549及H1299細(xì)胞株,培養(yǎng)條件及siRNA轉(zhuǎn)染條件同第二部分。2 siRNA細(xì)胞轉(zhuǎn)染聯(lián)合藥物處理細(xì)胞及分組2.1轉(zhuǎn)染聯(lián)合gefitinib將細(xì)胞分為Negative control siRNA(NC組)、AXL siRNA、NC+gefitinib、AXLsiRNA+gefitinib四組。按照上述方法培養(yǎng)并轉(zhuǎn)染細(xì)胞,轉(zhuǎn)染后24小時(shí)加入gefitinib使終濃度為10n M,繼續(xù)作用24小時(shí)收取細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。2.2轉(zhuǎn)染聯(lián)合Docetaxel將細(xì)胞分為Negative control siRNA(NC組)、AXL siRNA、NC+Docetaxel、AXLsiRNA+Docetaxel四組。按照上述方法培養(yǎng)并轉(zhuǎn)染細(xì)胞,轉(zhuǎn)染后24小時(shí)加入Docetaxel使終濃度為20n M,繼續(xù)作用24小時(shí)收取細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。3 R428聯(lián)合藥物處理細(xì)胞及分組3.1 R428聯(lián)合gefitinib將細(xì)胞分為對(duì)照組、R428處理組、gefitinib(10n M)、R428聯(lián)合gefitinib四組。按2×104/m L密度將細(xì)胞均勻接種于6孔板中,貼壁后換成含1%血清的RPMI 1640培養(yǎng)基饑餓細(xì)胞24h后,加入R428和或gefitinib作用24h收集各組細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)。3.2 R428聯(lián)合Docetaxel將細(xì)胞分為對(duì)照組、R428處理組、docetaxel(20n M)、R428聯(lián)合docetaxel(20n M)四組。按2×104/m L密度將細(xì)胞均勻接種于6孔板中,貼壁后換成含1%血清的RPMI 1640培養(yǎng)基饑餓細(xì)胞24h后,加入R428和或docetaxel作用24h收集各組細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)。4 MTT檢測(cè)2×104個(gè)/孔細(xì)胞均勻接種于96孔板中,貼壁12小時(shí)后,按上述分組經(jīng)不同處理措施后,MTT比色法計(jì)算細(xì)胞存活率。5 FCM檢測(cè)細(xì)胞周期分布分別收集不同處理組細(xì)胞,備單細(xì)胞懸液,70%乙醇4℃固定過(guò)夜。PI避光染色30min,1h內(nèi)上機(jī)檢測(cè),應(yīng)用Flow Jo 7.6軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。6 FCM檢測(cè)細(xì)胞凋亡分別收集不同處理組細(xì)胞,采用Annexin-V/PI試劑盒,通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞在A或D狀態(tài)下的凋亡情況,應(yīng)用Flow Jo 7.6軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。7統(tǒng)計(jì)分析所有數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS Statistics19.0軟件,數(shù)據(jù)分析采用方差分析或T檢驗(yàn);計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±SD)表示。P0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果:1 AXL siRNA干擾聯(lián)合gefitinib對(duì)A549與H1299細(xì)胞生長(zhǎng)的影響及機(jī)制探討1.1 MTT檢測(cè)在A549與H1299細(xì)胞中,與NC組相比,AXL siRNA干擾組、NC+gefitinib組及AXL siRNA+gefitinib組細(xì)胞存活率均顯著降低(P0.05)。與AXL siRNA干擾組、NC+gefitinib組相比,AXL siRNA+gefitinib組細(xì)胞存活率顯著降低(P0.05)。1.2 FCM檢測(cè)細(xì)胞周期分布在A549與H1299細(xì)胞中,與NC組相比,僅AXL siRNA+gefitinib組細(xì)胞G0/G1期比例顯著增多,而G2/M期以及S期細(xì)胞比例顯著減少(P0.05);NC+gefitinib處理對(duì)細(xì)胞周期無(wú)顯著影響。組間比較:AXL siRNA+gefitinib組細(xì)胞G0/G1期比例雖顯著高于NC+gefitinib組(P0.05)。1.3 FCM檢測(cè)細(xì)胞凋亡在A549與H1299細(xì)胞中,與NC組相比,NC+gefitinib組及AXL siRNA+gefitinib組細(xì)胞凋亡率均顯著升高(P0.05)。組間比較,AXL siRNA+gefitinib組細(xì)胞凋亡率顯著高于AXL siRNA組及NC+gefitinib組(P0.05)。2.R428聯(lián)合gefitinib對(duì)A549與H1299細(xì)胞生長(zhǎng)的影響及機(jī)制探討2.1 MTT檢測(cè)在A549與H1299細(xì)胞中,與對(duì)照組相比,R428處理組、gefitinib組以及R428聯(lián)合gefitinib組細(xì)胞存活率均明顯被抑制(P0.05)。組間比較:R428聯(lián)合gefitinib組細(xì)胞存活率最低,明顯低于gefitinib組和R428干預(yù)組(P0.05)。2.2 FCM檢測(cè)細(xì)胞周期分布在A549與H1299細(xì)胞中,與對(duì)照組相比,R428處理組、R428聯(lián)合gefitinib組細(xì)胞G0/G1期比例顯著增多,G2/M期、S其細(xì)胞比例相應(yīng)減少(P0.05)。組間比較:R428聯(lián)合gefitinib組細(xì)胞G0/G1期比例雖顯著高于gefitinib組(P0.05)。2.3 FCM檢測(cè)細(xì)胞凋亡在A549與H1299細(xì)胞中,與對(duì)照組相比,gefitinib處理組、R428聯(lián)合gefitinib組細(xì)胞凋亡率顯著增加(P0.05)。組間比較:R428聯(lián)合gefitinib處理組細(xì)胞凋亡率較R428處理組、gefitinib處理組均顯著增加(P0.05)。3.AXL siRNA干擾聯(lián)合Docetaxel對(duì)A549和H1299細(xì)胞生長(zhǎng)的影響及機(jī)制探討:3.1 MTT檢測(cè)在A549與H1299細(xì)胞中,與NC相比,AXL siRNA干擾組、NC+docetaxel組及AXL siRNA+docetaxel組細(xì)胞存活率均出現(xiàn)不同程度降低(P0.05)。組間比較:在A549細(xì)胞中AXL siRNA+docetaxel組細(xì)胞存活率低于NC+docetaxel組與AXL siRNA干擾組(P0.05)。在H1299細(xì)胞中,聯(lián)合用藥組與單獨(dú)處理組均無(wú)顯著差異。3.2 FCM檢測(cè)細(xì)胞周期分布在A549與H1299細(xì)胞中,與NC組相比,NC+docetaxel組細(xì)胞處于G2/M期比例顯著增加G0/G1期細(xì)胞比例則顯著降低提示docetaxel可引起細(xì)胞發(fā)生G2/M期周期阻滯。組間比較:與NC+docetaxel相比,在A549細(xì)胞中AXL siRNA+docetaxel處理組細(xì)胞G2/M期比例顯著降低,而G0/G1期細(xì)胞則顯著增加(P0.05)。在H1299細(xì)胞中,NC+docetaxel與AXL siRNA+docetaxel組相比,各期細(xì)胞比例無(wú)顯著差異(P0.05)。3.3 FCM檢測(cè)細(xì)胞凋亡在A549與H1299細(xì)胞中,與NC組相比,NC+docetaxel組及AXL siRNA+docetaxel組細(xì)胞凋亡率均顯著升高(P0.05)。組間比較:AXL siRNA+docetaxel組細(xì)胞凋亡率顯著高于AXL siRNA組(P0.05)。4 R428聯(lián)合docetaxel對(duì)A549和H1299細(xì)胞生長(zhǎng)的影響及機(jī)制探討:4.1 MTT檢測(cè):在A549和H1299細(xì)胞中,與對(duì)照組相比,R428處理組、docetaxel處理組、R428聯(lián)合docetaxel處理組細(xì)胞活存率均降低(P0.05)。組間比較:R428聯(lián)合docetaxel組細(xì)胞存活率最低,顯著低于docetaxel組和R428處理組(P0.05)。4.2 FCM檢測(cè)細(xì)胞周期分布在A549和H1299細(xì)胞中,與對(duì)照組相比,docetaxel處理組細(xì)胞處于G2/M期比例顯著增加G0/G1期細(xì)胞比例則顯著降低(P0.05);R428處理組細(xì)胞G0/G1期比例顯著增多,G2/M期、S期細(xì)胞比例相應(yīng)減少(P0.05)。組間比較:與單獨(dú)docetaxel組相比,R428聯(lián)合docetaxel處理組細(xì)胞G2/M期比例顯著降低,而G0/G1期細(xì)胞則相應(yīng)顯著增加(P0.05)。4.3 FCM檢測(cè)細(xì)胞凋亡在A549和H1299細(xì)胞中,與對(duì)照組相比,docetaxel組及R428聯(lián)合docetaxel處理組細(xì)胞凋亡率均顯著升高(P0.05)。組間比較:R428聯(lián)合docetaxel處理組細(xì)胞凋亡率顯著高于R428處理組(P0.05)。小結(jié):1 Gefitinib處理A549與H1299細(xì)胞,對(duì)細(xì)胞周期影響不顯著,但可促進(jìn)細(xì)胞凋亡,從而抑制細(xì)胞的增殖活性。2 Docetaxel處理A549與H1299細(xì)胞,可引起明顯的G2/M期周期阻滯,發(fā)揮其對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用。3 AXL siRNA轉(zhuǎn)染/R428聯(lián)合gefitinib處理,對(duì)A549與H1299細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用高于單獨(dú)處理組,其對(duì)生長(zhǎng)的抑制與引起細(xì)胞G0/G1阻滯或促進(jìn)凋亡相關(guān)。4 R428聯(lián)合docetaxel處理對(duì)A549與H1299細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用高于單獨(dú)處理組,其抑制作用與引起細(xì)胞G0/G1、G2/M期細(xì)胞周期阻滯或促進(jìn)凋亡相關(guān)。結(jié)論:1 109例肺腺癌組織中,EGFR 19外顯子缺失突變、21外顯子L858R突變的發(fā)生率較高(62.4%),而20外顯子T790M原發(fā)突變僅為1.83%。2 109例肺腺癌病例中,AXL蛋白表達(dá)在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組病例中顯著高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組;EGFR蛋白表達(dá)與腺癌亞型、腫瘤大小及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān);pEGFR1068蛋白表達(dá)與腫瘤大小及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)。3 AXL表達(dá)與EGFR突變狀態(tài)間無(wú)顯著相關(guān)性;EGFR、pEGFR1068表達(dá)與EGFR21外顯子L858R點(diǎn)突變顯著相關(guān),而且pEGFR1068在攜帶19 Del或L858R突變患者表達(dá)顯著增加,提示EGFR Tyr-1068位點(diǎn)磷酸化與EGFR敏感突變有關(guān)。4 AXL+/EGFR+/pEGFR1068共表達(dá)率在EGFR突變組顯著高于野生型肺腺癌患者,表明在部分原發(fā)肺腺癌病例中AXL與EGFR通路間存在共表達(dá)情況。體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步表明,p-AKT作為AXL與EGFR共同的下游信號(hào)分子,AXL對(duì)p-AKT的調(diào)節(jié)可能是AXL激酶與EGFR下游通路的交叉點(diǎn)之一。5 轉(zhuǎn)染AXL siRNA或給予20n M AXL激酶抑制劑-R428處理A549與H1299細(xì)胞,可顯著抑制細(xì)胞的增殖活性,其機(jī)制與細(xì)胞發(fā)生G0/G1期阻滯或促進(jìn)細(xì)胞凋亡有關(guān)。同時(shí),抑制AXL可顯著降低細(xì)胞的遷移能力。6 Gefitinib或docetaxel單獨(dú)處理A549與H1299細(xì)胞,可顯著抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)。其中g(shù)efitinib可促進(jìn)細(xì)胞凋亡從而抑制細(xì)胞的增殖活性,而docetaxel可引起明顯的G2/M期周期阻滯,發(fā)揮其對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用。7 AXL siRNA轉(zhuǎn)染/R428聯(lián)合gefitinib或docetaxel處理,對(duì)A549與H1299細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用高于單獨(dú)處理組,其對(duì)生長(zhǎng)的抑制與引起細(xì)胞G0/G1、G2/M阻滯或促進(jìn)凋亡相關(guān)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：R734.2

【參考文獻(xiàn)】

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1 符江琳;劉承云;徐曉;劉存飛;陳星霖;;Gas6經(jīng)PI3K/Akt通路對(duì)缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)H9c2細(xì)胞凋亡的影響[J];中國(guó)病理生理雜志;2011年08期

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本文編號(hào)：1402779