發(fā)布時(shí)間：2018-01-09 18:28

  本文關(guān)鍵詞：血源性人細(xì)小病毒核酸檢測(cè)體系建立與人細(xì)小病毒B19分子特性分析　出處：《中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：血液制品的病毒安全性一直是倍受關(guān)注的熱點(diǎn)問題。隨著輸血傳播病毒篩查技術(shù)以及病毒滅活/去除技術(shù)的發(fā)展應(yīng)用,人免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)、乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)及丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)等對(duì)血液制品安全的威脅已極大降低。人細(xì)小病毒B19(human parvovirus B19,B19病毒)和人細(xì)小病毒4(human parvovirus4,PARV4)成為了新的威脅血液制品安全性的病原體,近年來日益引起人們的關(guān)注。為降低B19病毒經(jīng)血液制品傳播的潛在風(fēng)險(xiǎn),國(guó)際組織及發(fā)達(dá)國(guó)家均采取了一系列監(jiān)控措施,建議/要求在血液制品生產(chǎn)過程中使用B19病毒核酸擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù)(nucleic acid amplification technology,NAT)作為在線控制措施,保證用于血液制品生產(chǎn)的混合原料血漿中B19病毒載量不高于104 IU/m L。PARV4因其生物學(xué)特性、理化特性等與B19病毒高度相似而引起關(guān)注,其也有可能通過血液制品輸注途徑傳播,但國(guó)外尚未制定相關(guān)監(jiān)控措施及標(biāo)準(zhǔn)。我國(guó)目前對(duì)于原料血漿中細(xì)小病毒的監(jiān)控尚無任何相關(guān)文件和技術(shù)指導(dǎo)原則,對(duì)于獻(xiàn)血/獻(xiàn)漿人群中細(xì)小病毒的攜帶情況以及原料血漿中的污染狀況缺乏足夠的基礎(chǔ)性數(shù)據(jù),也沒有對(duì)國(guó)內(nèi)現(xiàn)有毒株特性進(jìn)行系統(tǒng)分析。根據(jù)以上研究背景,結(jié)合我國(guó)實(shí)際情況,本研究主要進(jìn)行了以下幾方面工作:(1)人細(xì)小病毒B19通用核酸檢測(cè)體系中競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)標(biāo)的優(yōu)化與評(píng)價(jià)在前期建立的基于實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)(fluorescence-based quantitative real-time PCR,qPCR)的B19病毒通用核酸檢測(cè)體系基礎(chǔ)上,對(duì)競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)標(biāo)的構(gòu)建方法進(jìn)行優(yōu)化。將競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)標(biāo)的擴(kuò)增片段克隆到M13mp18噬菌體載體中,轉(zhuǎn)染XL1-Blue感受態(tài)細(xì)胞獲得了噬菌體蛋白包裹單鏈DNA的競(jìng)爭(zhēng)性噬菌體內(nèi)標(biāo)M13mp18-IC,并確定了該內(nèi)標(biāo)在血漿樣品中的最佳添加濃度為10 copies/μL。最后對(duì)添加內(nèi)標(biāo)的B19病毒檢測(cè)體系分別進(jìn)行了敏感性、特異性、重復(fù)性和準(zhǔn)確性評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示,B19病毒通用核酸檢測(cè)體系的定量下限可達(dá)10 copies/μL,即可對(duì)病毒載量低至492 IU/mL的血漿中B19病毒核酸進(jìn)行準(zhǔn)確定量;與其他經(jīng)血傳播病毒均無交叉反應(yīng);5×107~5×101 copies/μL濃度范圍內(nèi),B19病毒參考品質(zhì)粒在批內(nèi)和批間重復(fù)實(shí)驗(yàn)中各濃度質(zhì)粒的Cq值變異系數(shù)均小于2%,批內(nèi)和批間實(shí)驗(yàn)中,各濃度B19病毒參考品質(zhì)粒的拷貝數(shù)平均變異系數(shù)分別為8.60%和9.17%;1×108~1×104 copies/μL濃度范圍內(nèi),B19病毒通用核酸檢測(cè)體系具有高度準(zhǔn)確性(斜率=1.005)。本研究建立的B19病毒通用核酸檢測(cè)體系,既有良好的敏感性、特異性、重復(fù)性和準(zhǔn)確性,又可有效的避免因核酸提取和/或抑制物存在等所導(dǎo)致的假陰性檢測(cè)結(jié)果,可用于將來對(duì)血液制品生產(chǎn)用混合原料血漿的B19病毒NAT篩查,對(duì)于保障我國(guó)血液制品安全性具有重要意義。此外,此檢測(cè)體系還可應(yīng)用于B19病毒感染的早期診斷,為下一步B19病毒診斷試劑盒的研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。(2)人細(xì)小病毒B19-人細(xì)小病毒4雙重核酸檢測(cè)體系的建立與評(píng)價(jià)首先分別合成B19病毒、PARV4的通用檢測(cè)引物與探針,根據(jù)輔助噬菌體M13K07序列設(shè)計(jì)和合成非競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)標(biāo)的檢測(cè)引物與探針,并合成或構(gòu)建B19病毒、PARV4和非競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)標(biāo)的參考品質(zhì)粒。然后分別對(duì)B19病毒和PARV4的qPCR的退火溫度、探針濃度和引物濃度以及反應(yīng)體系中MgCl2+濃度等進(jìn)行優(yōu)化,確定了最佳反應(yīng)體系和條件。確定非競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)標(biāo)在血漿樣品中的最佳添加濃度(2.5 copies/μL)后,對(duì)雙重核酸檢測(cè)體系分別進(jìn)行了敏感性、特異性和重復(fù)性評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示B19病毒和PARV4檢測(cè)下限均可達(dá)5 copies/μL;與其他經(jīng)血傳播病毒均無交叉反應(yīng);5×106~5×101 copies/μL濃度范圍內(nèi),B19病毒和PARV4參考品質(zhì)粒在批內(nèi)和批間重復(fù)實(shí)驗(yàn)中各濃度質(zhì)粒的Cq值變異系數(shù)均小于2%;批內(nèi)實(shí)驗(yàn)中,B19病毒和PARV4各濃度參考品質(zhì)粒拷貝數(shù)的平均變異系數(shù)分別為4.74%和5.97%,批間實(shí)驗(yàn)中平均變異系數(shù)分別為8.22%和12.29%。本研究建立的B19病毒-PARV4雙重核酸檢測(cè)體系,既有較高的敏感性、特異性和重復(fù)性,又可有效的避免因核酸提取和/或抑制物存在等所導(dǎo)致的假陰性檢測(cè)結(jié)果。為進(jìn)行我國(guó)獻(xiàn)血/獻(xiàn)漿人群中B19病毒與PARV4的核酸檢測(cè)奠定了基礎(chǔ)。(3)我國(guó)獻(xiàn)血/獻(xiàn)漿人群中血源性人細(xì)小病毒的檢測(cè)應(yīng)用本研究建立的B19病毒-PARV4雙重核酸檢測(cè)體系,對(duì)我國(guó)北京地區(qū)和西安地區(qū)共計(jì)1151份單人份獻(xiàn)血員血漿進(jìn)行B19病毒和PARV4核酸檢測(cè)。結(jié)果顯示,共有5份單人份血漿為B19病毒核酸陽(yáng)性,總陽(yáng)性率為0.43%,病毒載量為6.80×102~1.38×105 copies/m L;其中西安地區(qū)B19病毒DNA陽(yáng)性率為0.3%(3/1000),北京地區(qū)陽(yáng)性率為1.32%(2/151);而所有血漿均為PARV4核酸陰性。應(yīng)用本研究建立的B19病毒通用核酸檢測(cè)體系,對(duì)我國(guó)三家不同血液制品企業(yè)的共計(jì)235份混合原料血漿樣品進(jìn)行了B19病毒核酸檢測(cè)。結(jié)果顯示,169份(169/235,71.91%)樣品存在B19病毒污染,病毒載量為5.18×102~1.05×109IU/m L;其中115份樣品(115/169,68.05%)的B19病毒核酸陽(yáng)性的樣品病毒載量高于104 IU/mL。結(jié)果表明,本研究中獻(xiàn)血人群的B19病毒和PARV4核酸陽(yáng)性率和病毒載量均較低。但混合原料血漿中B19病毒的污染率和污染程度相對(duì)較高,使得血液制品存在傳播B19病毒的潛在風(fēng)險(xiǎn),因此建議我國(guó)血液制品企業(yè)對(duì)原料血漿進(jìn)行B19病毒NAT篩查,對(duì)于保障血液制品的病毒安全性具有重要意義。(4)我國(guó)獻(xiàn)血/漿人群中人細(xì)小病毒B19分子特性分析對(duì)123份B19病毒核酸陽(yáng)性血漿樣品進(jìn)行了B19病毒NS1-VP1u區(qū)的克隆和測(cè)序,與GenBank上的B19病毒參考序列多重比對(duì)后,進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析和重組分析。系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果顯示,在我國(guó)至少有3種亞型(1a、1b和3b)的B19病毒傳播,其中1a亞型占主導(dǎo)地位(78/123,63.41%),其次為3b亞型(21/123,17.07%)和1b亞型(12/123,9.76%),沒有B19病毒2型的存在。重組分析結(jié)果顯示,有4個(gè)序列為B19病毒1a/3b重組型,5個(gè)序列中沒有檢測(cè)到重組信號(hào),可能為B19病毒新的亞型。此外,對(duì)部分樣品中B19病毒近全長(zhǎng)序列進(jìn)行了克隆與測(cè)序,與GenBank上的B19病毒參考序列多重比對(duì)后,進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。共獲得6個(gè)B19病毒近全長(zhǎng)序列,系統(tǒng)發(fā)育分析顯示其均為B19病毒1a亞型。本研究首次發(fā)現(xiàn)在我國(guó)至少有3種亞型B19病毒(1a、1b和3b)的流行,并首次發(fā)現(xiàn)B19病毒1a/3b重組型和可能新基因亞型的存在。有助于了解不同基因型B19病毒在我國(guó)的流行情況及其進(jìn)化趨勢(shì),對(duì)于B19病毒感染的預(yù)防和控制以及保障輸血和血液制品病毒安全性具有重要意義。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R392

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本文編號(hào)：1402191