發(fā)布時(shí)間：2018-01-11 10:00

  本文關(guān)鍵詞：miR-155在創(chuàng)面愈合中的作用及機(jī)制研究　出處：《第四軍醫(yī)大學(xué)》2015年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：皮膚組織缺損在臨床上十分常見,一般由各種急、慢性致傷因素,如機(jī)械損傷、燒傷、體表腫瘤切除、慢性潰瘍等導(dǎo)致。創(chuàng)面愈合是在多種細(xì)胞及細(xì)胞因子共同參與下完成的復(fù)雜病理生理過程,主要涉及炎癥反應(yīng)、創(chuàng)面上皮化及收縮、膠原沉積及重塑這三個(gè)過程,而這三個(gè)過程是相互影響及相互調(diào)控的。嚴(yán)重創(chuàng)面愈合后往往膠原過度沉積,導(dǎo)致纖維化及疤痕形成,如何在促進(jìn)創(chuàng)面愈合的同時(shí)減輕愈后纖維化程度一直是燒傷及各學(xué)科研究的熱點(diǎn),然而目前仍無理想結(jié)果。因此,探索新的促創(chuàng)面愈合、減輕愈后纖維化程度的途徑,是急需解決的重大臨床問題之一。micro RNA是一類短鏈非編碼RNA,通過轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控蛋白表達(dá)來發(fā)揮功能,在創(chuàng)面愈合及纖維化疾病中發(fā)揮重要作用。mi R-203及mi R-210分別通過促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞遷移及增殖來促進(jìn)創(chuàng)面愈合,而mi R-99及mi R-200家族則可抑制角質(zhì)形成細(xì)胞遷移而延緩創(chuàng)面愈合。mi R-155早期研究主要集中在免疫領(lǐng)域,并發(fā)現(xiàn)mi R-155在炎性細(xì)胞發(fā)育及免疫反應(yīng)調(diào)控中發(fā)揮重要作用,近期研究還發(fā)現(xiàn)mi R-155可以通過促進(jìn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化而促進(jìn)上皮細(xì)胞遷移。因此,我們猜測mi R-155可以通過促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞遷移而促進(jìn)創(chuàng)面愈合,并可以通過調(diào)控創(chuàng)面炎性細(xì)胞功能而影響創(chuàng)面愈合后纖維化程度,在創(chuàng)面愈合及創(chuàng)面愈后纖維化中發(fā)揮重要作用。本研究擬通過創(chuàng)面局部注射mi R-155 plasmid及antagomir來調(diào)控創(chuàng)面局部mi R-155水平,在體內(nèi)觀察mi R-155在創(chuàng)面愈合及愈合后纖維化中的作用,以及體外細(xì)胞模型進(jìn)行驗(yàn)證,并對其可能機(jī)制進(jìn)行研究。方法:1、在SD大鼠背部造成1×1 cm全層皮膚缺損模型,創(chuàng)面局部注射mi R-155plasmid后觀察其對創(chuàng)面愈合及上皮化速度的影響;成纖維細(xì)胞三維凝膠收縮實(shí)驗(yàn)及體內(nèi)外α-SMA染色觀察mi R-155 plasmid對創(chuàng)面收縮的影響。2、采用角質(zhì)形成細(xì)胞劃痕及Transwell細(xì)胞穿膜實(shí)驗(yàn)來觀察mi R-155對角質(zhì)形成細(xì)胞遷移的影響;采用Ki-67染色、MTT生長曲線測定及流式細(xì)胞周期檢測的方法來觀察mi R-155 plasmid對角質(zhì)形成細(xì)胞增殖的影響。3、通過F-actin、E-cadherin、β-catenin、MMPs、TIMPs等與細(xì)胞遷移相關(guān)蛋白的檢測來探討mi R-155 plasmid促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞遷移的可能分子機(jī)制。4、SD大鼠創(chuàng)面病理染色觀察mi R-155 plasmid對創(chuàng)面炎性細(xì)胞浸潤數(shù)量的影響;通過愈后Ⅰ/Ⅲ膠原沉積水平檢測來觀察mi R-155 plasmid對創(chuàng)面愈后纖維化程度的影響。5、在C57小鼠背部全層皮膚缺損模型中注射mi R-155 antagomir并觀察其對創(chuàng)面愈合速度影響;通過創(chuàng)面局部炎性細(xì)胞HE及免疫組化染色、炎性因子水平測定來觀察創(chuàng)面局部注射mi R-155 antagomir對創(chuàng)面局部炎性細(xì)胞功能的影響。6、通過檢測創(chuàng)面愈合后局部Ⅰ/Ⅲ膠原沉積量、Masson膠原染色來觀察mi R-155antagomir局部注射對C57小鼠背部創(chuàng)面愈后纖維化程度的影響。結(jié)果:1、SD大鼠背部全層皮膚缺損模型中,創(chuàng)面局部注射mi R-155 plasmid能使創(chuàng)面局部mi R-155水平與對照組相比顯著升高,并且創(chuàng)面愈合速度明顯加快,病理染色顯示mi R-155可以明顯促進(jìn)創(chuàng)面上皮化;mi R-155對成纖維細(xì)胞三維凝膠收縮、體內(nèi)外成纖維細(xì)胞α-SMA蛋白表達(dá)均無明顯影響。結(jié)果提示mi R-155可以通過加速創(chuàng)面上皮化而促進(jìn)創(chuàng)面愈合,對創(chuàng)面收縮無明顯影響。2、細(xì)胞劃痕及Transwell細(xì)胞穿膜實(shí)驗(yàn)證實(shí)mi R-155可以促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞遷移;mi R-155對角質(zhì)形成細(xì)胞Ki-67表達(dá)、生長曲線、細(xì)胞周期等都無明顯影響。提示mi R-155在促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞遷移的同時(shí)對角質(zhì)形成細(xì)胞增殖無明顯影響。3、Western blot及免疫組化/熒光染色顯示mi R-155對E-cadherin、β-catenin、F-actin、MMP-9等蛋白表達(dá)均無明顯影響;mi R-155能引起MMP-2蛋白表達(dá)升高,并且MMP-2特異性抑制劑ARP101能部分抑制mi R-155誘導(dǎo)的角質(zhì)形成細(xì)胞遷移增快,提示MMP-2在mi R-155誘導(dǎo)的角質(zhì)形成細(xì)胞遷移增快及創(chuàng)面愈合加快中發(fā)揮重要作用,并且還有其他機(jī)制參與mi R-155誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞遷移增快。4、SD大鼠皮膚缺損創(chuàng)面mi R-155 plasmid局部注射能增加創(chuàng)面中性粒細(xì)胞浸潤數(shù)量,創(chuàng)面愈合后Ⅰ/Ⅲ膠原沉積量也明顯增加。提示mi R-155能增強(qiáng)創(chuàng)面局部炎性細(xì)胞數(shù)量并導(dǎo)致愈后纖維化程度加劇。5、C57小鼠背部皮膚缺損創(chuàng)面mi R-155 antagomir局部注射能顯著降低創(chuàng)面局部mi R-155水平,創(chuàng)面局部中性粒細(xì)胞及巨噬細(xì)胞浸潤數(shù)量顯著減少,同時(shí)促炎因子TNF-α、IL-β水平顯著降低、抑炎因子IL-10水平顯著增加;與對照組相比mi R-155antagomir局部注射對創(chuàng)面愈合速度無明顯影響。結(jié)果提示創(chuàng)面局部低表達(dá)mi R-155可以調(diào)控創(chuàng)面炎性細(xì)胞功能但對創(chuàng)面愈合速度無明顯影響。6、C57小鼠背部全層皮膚缺損創(chuàng)面mi R-155 antagomir局部注射愈合后Ⅰ/Ⅲ膠原、α-SMA蛋白表達(dá)顯著降低,Masson膠原染色提示局部膠原排列更整齊、稀疏,表明mi R-155 antagomir可以減輕創(chuàng)面愈后纖維化程度,提高創(chuàng)面愈合質(zhì)量。結(jié)論:創(chuàng)面局部高表達(dá)mi R-155能夠通過促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞遷移加速創(chuàng)面上皮化而促進(jìn)創(chuàng)面愈合,MMP-2在mi R-155所誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞遷移增快中發(fā)揮重要作用,同時(shí)創(chuàng)面炎性細(xì)胞浸潤數(shù)量增加,創(chuàng)面愈后纖維化程度加劇;創(chuàng)面局部低表達(dá)mi R-155能通過調(diào)控創(chuàng)面炎性細(xì)胞功能而減輕創(chuàng)面愈后纖維化程度,對創(chuàng)面愈合速度無明顯影響。
[Abstract]:In this study , the effects of mi R - 155 and mi R - 210 on wound healing and wound healing were studied . The effects of mi R - 155 plasmid on the proliferation of keratinocytes were observed by MTT growth curve assay and flow cytometry . The effects of mi R - 155 plasmid on the wound healing rate were observed . The results suggested that the local injection of mi R - 155 could increase the number of local inflammatory cells and increase the wound healing .

【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R641
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本文編號：1409054