發(fā)布時間：2018-01-11 09:21

  本文關鍵詞：鈣通道CACNA1C基因突變致心原性猝死相關早期復極的分子遺傳學機制探討　出處：《南昌大學》2017年博士論文　論文類型：學位論文

  更多相關文章： 心原性猝死 家系 早期復極綜合征 CACNA1C基因 基因突變 Cav1.2 L型鈣離子通道 分子遺傳 細胞電生理 藥物篩選

【摘要】：研究背景心原性猝死(sudden cardiac death,SCD)是人類健康頭號殺手心血管疾病導致的突發(fā)性自然死亡。在諸多SCD高發(fā)的心血管疾病中,具有極高風險尤其對年輕人造成危害的遺傳性心律失常綜合征日漸受到關注。主要由各種離子通道蛋白及其調(diào)控蛋白編碼基因突變導致的遺傳性心律失常綜合征通常不伴心臟結構功能異常,而呈現(xiàn)以各種特征性的心電圖形態(tài),在特殊環(huán)境狀態(tài)下誘發(fā)嚴重的心電生理活動紊亂促使惡性心律失常發(fā)生,從而導致SCD。早期復極(early repolarization,ER)是部分心肌提前復極形成心電圖上J點抬高和非心肌缺血性ST段抬高的特殊波形,在人群中廣泛存在,且在半個世紀以來被認為是一種正常的心電圖表現(xiàn)。隨著流行病學調(diào)查研究的大力開展,部分有ER表現(xiàn)的人群被發(fā)現(xiàn)存在SCD風險及家族聚集現(xiàn)象。如何辨別具有SCD風險的ER表現(xiàn)成為臨床醫(yī)生所面臨的棘手問題。在最新的遺傳性心律失常綜合征診治共識中,這類具有惡性心律失常病史或SCD家族史且心臟結構正常,"g2個連續(xù)下壁和/或側(cè)壁導聯(lián)出現(xiàn)J點抬高"g1 mm心電圖表現(xiàn)的一組臨床癥候群被定義為早期復極綜合征(earl repolarization syndrome,ERS)。近年來分子遺傳學理論和技術的飛速發(fā)展極大地推動了人們對遺傳性心律失常綜合征中各類疾病的認知與探索。編碼ATP敏感性鉀離子通道Kir6.1的KCNJ8和ABCC9基因,編碼L型鈣離子通道的CACNA1C、CACNB2b和CACNA2D1基因,以及編碼鈉離子通道的SCN5A基因突變相繼在ERS中報道。突變導致的外向鉀離子通道功能增強和內(nèi)向鈣離子或鈉離子通道功能減弱被認為是ERS的病理性致病基礎。ER不同于長QT綜合征和Brugada綜合征等其它具有顯著遺傳學特性的遺傳性心律失常綜合征類型,ERS致病基因突變多見于散發(fā)病例,具有家族遺傳性的基因突變罕見。此外,國人ERS的遺傳學研究報道罕見,由此可見國人相關致病基因突變的研究仍存在很大空間,對有明顯癥狀或猝死家族史的家系進行級聯(lián)式遺傳學篩查才能高效地篩查致病基因突變,并探索ERS分子遺傳學發(fā)病機制,從而尋找更加有效的ERS個體化治療方案。第一部分心原性猝死大家系臨床分析及遺傳學檢測目的:本研究通過對所收集的SCD大家系先證者及存活成員進行全面的臨床評估,并對先證者尸檢報告仔細分析以及家系成員SCD候選基因篩查檢測,解析該家系SCD發(fā)生機制,以異常心電圖表現(xiàn)為線索尋找潛在的致死性原因及致病基因突變,為該家系SCD高危成員提供診療建議。方法:1.臨床資料收集:嚴格遵循醫(yī)學倫理準則,經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審批獲準及入選研究對象知情同意,對我院心內(nèi)科就診的江西籍SCD高�；颊呒捌溆H屬臨床資料進行采集。診斷標準參考2013年由美國心律協(xié)會(Heart Rhythm Society,HRS)、歐洲心律學會(European Heart Rhythm Association,EHRA)和亞太心律協(xié)會(Asia Pacific Heart Rhythm Society,APHRS)共同制定的遺傳性心律失常綜合征患者診斷和治療專家共識,獲取家系成員病史,心電圖和心臟彩超等檢查信息。2.尸檢資料收集:在SCD死者法定代理人知情同意的情況下,獲取死者經(jīng)司法機構提供的尸檢報告及相關病理組織。3.先證者心肌組織HE染色:取死者心肌不同部位組織塊制作切片并HE染色,觀察心肌組織結構形態(tài)。4.遺傳學檢測:經(jīng)患者及其家屬知情同意后,采集外周靜脈全血5 ml儲存于EDTA真空抗凝管,采用血液基因組DNA提取試劑盒抽提外周血白細胞全基因組DNA,選擇常見的遺傳性心律失常綜合征致病基因作為候選基因,包括編碼鈉離子通道的SCN5A、SCN1B、SCN3B和GPA1L基因,編碼鉀離子通道的KCNQ1、KCNH2、KCNJ8、KCNE1、KCNE2和KCND3基因,編碼鈣離子通道的CACNA1C、CACNB2b和CACNA2D1基因以及編碼通道調(diào)節(jié)蛋白的ANK2和PRKAG2基因,設計相應引物,使所測范圍涵蓋待測基因所有外顯子以及外顯子與內(nèi)含子交界區(qū)序列,采用DNA直接測序法(雙脫氧鏈終止法)進行測序篩查基因變異,隨機選取本實驗室DNA庫中400例相同遺傳背景及年齡性別匹配的正常健康人群標本作為對照,以發(fā)現(xiàn)新的致病基因突變位點或單核苷酸多態(tài)性(single-nucleotide polymorphisms,SNPs)。5.統(tǒng)計學分析:所有涉及統(tǒng)計的實驗數(shù)據(jù)均采用SPSS19.0軟件包統(tǒng)計學分析軟件進行分析。計量資料以均數(shù)±標準誤((?)±s)表示,兩組間比較采用t檢驗,多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA),P值0.05具有統(tǒng)計學意義,P值0.01具有顯著統(tǒng)計學意義。結果:1.本研究收集到一個原因不明夜間猝死大家系,死者為包含先證者在內(nèi)的5名男性成員,先后在睡眠中發(fā)生猝死,均處青壯年時期,最小23歲,最大49歲,平均年齡34±8.4歲。2.先證者尸檢報告提示無機械性損傷、機械性窒息致死的法醫(yī)病理學改變,也無中毒致死的依據(jù);組織病理學檢查結果排外各主要器官器質(zhì)性病變,考慮猝死可能由心原性因素所致。所取心肌組織形態(tài)結構及排列均正常,可排外心肌病等各種結構性心臟病以及可伴右室心肌病變的Brugada綜合征。先證者死前3年內(nèi)偶發(fā)頭暈、心悸,無胸悶、胸痛及暈厥;既往心臟彩超檢查無明顯異常,24小時3導聯(lián)動態(tài)心電圖記錄II導聯(lián)和a VF導聯(lián)J點抬高"g1.5mm。3.其他家庭成員既往史及個人史無特殊,無陽性體征,靜息心電圖、心臟彩超及平板運動試驗檢查未見明顯異常。24 h動態(tài)心電圖檢查發(fā)現(xiàn)3位家庭成員有ER表現(xiàn)。其中先證者弟弟ER表現(xiàn)最為顯著,下壁II、III和a VF導聯(lián),胸前V3~V5導聯(lián)J點抬高0.05 m V~0.3 m V,且可見J波,V2~V4導聯(lián)T波高尖。先證者兒子及其弟弟女兒的動態(tài)心電圖表現(xiàn)為下壁和側(cè)壁導聯(lián)ST段抬高。4.通過候選基因測序篩查發(fā)現(xiàn)該家系1個鈣離子通道α1亞單位編碼基因CACNA1C的雜合錯義突變,由第48號外顯子上第5747號堿基A轉(zhuǎn)換為堿基G,導致第1916位谷氨酰胺變?yōu)榫�氨�?即p.Q1916R。該突變見于先證者及源于父系的所有一級和二級親屬,而其母親及母親的兄弟姐妹和其他與先證者無血緣關系的家庭成員均不存在此突變。此外,在家系中還篩查到已被報道的5個CACNA1C基因SNPs,分別為c.2436CT(p.D812D),c.3786CT(p.F1262F),c.5361GA(p.T1787T),c.5609CT(p.T1870M)和c.5649GA(p.P1883P),以及1個SCN5A基因SNPs,c.3578GA(p.R1193Q)。5.CACNA1C-Q1916R突變攜帶者中有ER表現(xiàn)和無ER表現(xiàn)成員心電圖參數(shù)比較結果顯示,有ER表現(xiàn)成員的心率校正QT間期比無ER表現(xiàn)的成員短,但均在正常范圍,QT間期離散度(QT dispersion,QTd)和Tp-Te間期離散度(Tp-Te dispersion,Tp-ed)則更大,但兩組間各參數(shù)差異無統(tǒng)計學意義。結論:1.本研究從一個青壯年男性SCD高發(fā)大家系,揭示SCD可能與ERS相關。2.ERS致病基因CACNA1C-Q1916R新突變可能與該家系ERS致SCD相關。3.CACNA1C-Q1916R突變攜帶家庭成員中ER呈不完全外顯性,考慮與SCN5A-R1193Q和性別相關。4.ER家庭成員心電圖中有致惡性心律失常性作用的復極化跨壁離散度參數(shù)指標QTd和Tp-ed增大,但與無ER表現(xiàn)的CACNA1C突變攜帶成員比較無統(tǒng)計學差異,樣本量有限是可能原因。5.其它所發(fā)現(xiàn)的CACNA1C基因SNPs(D812D、F1262F、T1787T、T1870M和P1883P)無明顯致SCD效應。第二部分CACNA1C基因突變致心原性猝死相關ER的分子遺傳學、細胞電生理機制及藥物干預探討目的:從組織和細胞水平探討CACNA1C-Q1916R突變的功能變化及致SCD相關ER的分子機理,并篩選有效的治療藥物。方法:1.人心肌組織標本免疫組化:取攜帶CACNA1C基因突變先證者左心室肌組織,通過免疫組化法對組織內(nèi)由CACNA1C基因翻譯的Cav1.2蛋白表達及定位進行檢測,并以成年人正常左心室標本作為對照。2.CACNA1C-Q1916R定點突變:采用經(jīng)典的定點突變技術,將CACAN1C基因第5747位堿基A突變?yōu)閴A基G,進行測序驗證并排除其它位點突變。3.CACNA1C質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染:采用Lipofectamine?2000轉(zhuǎn)染試劑盒,將攜帶野生和突變型CACNA1C,以及野生型CACNB2b和CACNA2D1基因的質(zhì)粒載體按摩爾濃度1:1:1分兩組共轉(zhuǎn)染入人胚腎293細胞(human embryonic kidney293,HEK293)中用于后續(xù)實驗,用于膜片鉗細胞電生理實驗的細胞則按0.3比例額外轉(zhuǎn)染表達綠色熒光的p EGFP-N3質(zhì)粒。4.實時熒光定量PCR(Quantitative Real time PCR,q RT-PCR):采用q RT-PCR引物擴增表達野生和突變型CACNA1C的HEK293細胞中CACNA1C的序列片段,檢測突變對Cav1.2總m RNA表達的影響。5.蛋白免疫印跡(Western Blot):采用Western Blot檢測表達野生和突變型CACNA1C的HEK293細胞中,Cav1.2在細胞總蛋白、膜蛋白和漿蛋白各水平的表達情況。6.細胞免疫熒光:在共聚焦熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染野生和突變型CACNA1C并經(jīng)Cav1.2特異抗體熒光染色的HEK293細胞,檢測突變對Cav1.2表達定位及轉(zhuǎn)運的影響。7.全細胞膜片鉗細胞電生理分析及藥物篩選:采用全細胞膜片鉗技術記錄表達突變型CACNA1C的HEK293細胞上L型鈣離子流變化,以及雄激素睪酮(10μM)對其的影響。再分別加入ER治療藥物異丙腎上腺素(10μM)和奎尼丁(5μM),觀察藥物對鈣離子流的影響,繪制電流-電壓(I-V)曲線,電壓依賴的穩(wěn)態(tài)激活曲線(steady state activation,SSA)和電壓依賴的穩(wěn)態(tài)失活曲線(steady state inactivation,SSI)。8.統(tǒng)計學分析:所有涉及統(tǒng)計的實驗數(shù)據(jù)均采用SPSS19.0軟件包統(tǒng)計學分析軟件進行分析。計量資料以均數(shù)±標準誤((?)±s)表示,兩組間比較采用t檢驗,多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA),P值0.05具有統(tǒng)計學意義,P值0.01具有顯著統(tǒng)計學意義。結果:1.成功誘導CACNA1C-Q1916R突變,經(jīng)測序驗證CACAN1C基因第5747位堿基A突變?yōu)閴A基G,其它位點未發(fā)生突變。2.免疫組化結果顯示攜帶CACNA1C基因突變的先證者心室肌組織Cav1.2蛋白表達水平低于正常對照組織(*P0.05),異源性表達突變Cav1.2的總m RNA表達水平較野生型Cav1.2低(*P0.01),且在細胞總蛋白、模蛋白和漿蛋白各水平的表達均下降(*P0.05)。3.細胞免疫熒光結果顯示突變型Cav1.2蛋白轉(zhuǎn)運功能正常,但整體熒光強度更弱。4.全細胞膜片鉗結果顯示突變組鈣電流密度較野生組顯著降低,降低有統(tǒng)計學意義(*P0.05,**P0.01),SSA和SSI兩組間無差異;睪酮(10μM)可顯著降低突變組電流密度,差異有統(tǒng)計學意義(#P0.05);ERS治療藥物異丙腎上腺素(10μM)可增加野生型鈣電流密度,對突變型鈣電流的增加無統(tǒng)計學意義,可引起野生型和突變型鈣電流的電壓依賴性SSA均發(fā)生左移;奎尼丁(5μM)對野生型和突變型鈣電流的幅度、密度和電壓依賴性SSA均無任何影響。結論:1.CACNA1C-Q1916R為功能喪失性突變,可使Cav1.2在m RNA和蛋白質(zhì)水平表達量均降低,但不影響蛋白的定位及轉(zhuǎn)運,突變可能通過減少細胞膜上有效Cav1.2數(shù)量而降低鈣電流。2.CACNA1C-Q1916R突變是引起本研究家系中ER表現(xiàn)及SCD的主要原因。3.睪酮加劇CACNA1C-Q1916R突變鈣電流密度減小,證實男性是突變攜帶成員發(fā)生SCD和ER表現(xiàn)的重要危險因素。4.異丙腎上腺素可能對有ER表現(xiàn)及SCD高危的CACNA1C-Q1916R突變攜帶者有一定療效。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：南昌大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R541.78

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