發(fā)布時(shí)間：2018-01-11 09:21

  本文關(guān)鍵詞：鈣通道CACNA1C基因突變致心原性猝死相關(guān)早期復(fù)極的分子遺傳學(xué)機(jī)制探討　出處：《南昌大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

  更多相關(guān)文章： 心原性猝死 家系 早期復(fù)極綜合征 CACNA1C基因 基因突變 Cav1.2 L型鈣離子通道 分子遺傳 細(xì)胞電生理 藥物篩選

【摘要】：研究背景心原性猝死(sudden cardiac death,SCD)是人類健康頭號(hào)殺手心血管疾病導(dǎo)致的突發(fā)性自然死亡。在諸多SCD高發(fā)的心血管疾病中,具有極高風(fēng)險(xiǎn)尤其對年輕人造成危害的遺傳性心律失常綜合征日漸受到關(guān)注。主要由各種離子通道蛋白及其調(diào)控蛋白編碼基因突變導(dǎo)致的遺傳性心律失常綜合征通常不伴心臟結(jié)構(gòu)功能異常,而呈現(xiàn)以各種特征性的心電圖形態(tài),在特殊環(huán)境狀態(tài)下誘發(fā)嚴(yán)重的心電生理活動(dòng)紊亂促使惡性心律失常發(fā)生,從而導(dǎo)致SCD。早期復(fù)極(early repolarization,ER)是部分心肌提前復(fù)極形成心電圖上J點(diǎn)抬高和非心肌缺血性ST段抬高的特殊波形,在人群中廣泛存在,且在半個(gè)世紀(jì)以來被認(rèn)為是一種正常的心電圖表現(xiàn)。隨著流行病學(xué)調(diào)查研究的大力開展,部分有ER表現(xiàn)的人群被發(fā)現(xiàn)存在SCD風(fēng)險(xiǎn)及家族聚集現(xiàn)象。如何辨別具有SCD風(fēng)險(xiǎn)的ER表現(xiàn)成為臨床醫(yī)生所面臨的棘手問題。在最新的遺傳性心律失常綜合征診治共識(shí)中,這類具有惡性心律失常病史或SCD家族史且心臟結(jié)構(gòu)正常,"g2個(gè)連續(xù)下壁和/或側(cè)壁導(dǎo)聯(lián)出現(xiàn)J點(diǎn)抬高"g1 mm心電圖表現(xiàn)的一組臨床癥候群被定義為早期復(fù)極綜合征(earl repolarization syndrome,ERS)。近年來分子遺傳學(xué)理論和技術(shù)的飛速發(fā)展極大地推動(dòng)了人們對遺傳性心律失常綜合征中各類疾病的認(rèn)知與探索。編碼ATP敏感性鉀離子通道Kir6.1的KCNJ8和ABCC9基因,編碼L型鈣離子通道的CACNA1C、CACNB2b和CACNA2D1基因,以及編碼鈉離子通道的SCN5A基因突變相繼在ERS中報(bào)道。突變導(dǎo)致的外向鉀離子通道功能增強(qiáng)和內(nèi)向鈣離子或鈉離子通道功能減弱被認(rèn)為是ERS的病理性致病基礎(chǔ)。ER不同于長QT綜合征和Brugada綜合征等其它具有顯著遺傳學(xué)特性的遺傳性心律失常綜合征類型,ERS致病基因突變多見于散發(fā)病例,具有家族遺傳性的基因突變罕見。此外,國人ERS的遺傳學(xué)研究報(bào)道罕見,由此可見國人相關(guān)致病基因突變的研究仍存在很大空間,對有明顯癥狀或猝死家族史的家系進(jìn)行級聯(lián)式遺傳學(xué)篩查才能高效地篩查致病基因突變,并探索ERS分子遺傳學(xué)發(fā)病機(jī)制,從而尋找更加有效的ERS個(gè)體化治療方案。第一部分心原性猝死大家系臨床分析及遺傳學(xué)檢測目的:本研究通過對所收集的SCD大家系先證者及存活成員進(jìn)行全面的臨床評估,并對先證者尸檢報(bào)告仔細(xì)分析以及家系成員SCD候選基因篩查檢測,解析該家系SCD發(fā)生機(jī)制,以異常心電圖表現(xiàn)為線索尋找潛在的致死性原因及致病基因突變,為該家系SCD高危成員提供診療建議。方法:1.臨床資料收集:嚴(yán)格遵循醫(yī)學(xué)倫理準(zhǔn)則,經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審批獲準(zhǔn)及入選研究對象知情同意,對我院心內(nèi)科就診的江西籍SCD高危患者及其親屬臨床資料進(jìn)行采集。診斷標(biāo)準(zhǔn)參考2013年由美國心律協(xié)會(huì)(Heart Rhythm Society,HRS)、歐洲心律學(xué)會(huì)(European Heart Rhythm Association,EHRA)和亞太心律協(xié)會(huì)(Asia Pacific Heart Rhythm Society,APHRS)共同制定的遺傳性心律失常綜合征患者診斷和治療專家共識(shí),獲取家系成員病史,心電圖和心臟彩超等檢查信息。2.尸檢資料收集:在SCD死者法定代理人知情同意的情況下,獲取死者經(jīng)司法機(jī)構(gòu)提供的尸檢報(bào)告及相關(guān)病理組織。3.先證者心肌組織HE染色:取死者心肌不同部位組織塊制作切片并HE染色,觀察心肌組織結(jié)構(gòu)形態(tài)。4.遺傳學(xué)檢測:經(jīng)患者及其家屬知情同意后,采集外周靜脈全血5 ml儲(chǔ)存于EDTA真空抗凝管,采用血液基因組DNA提取試劑盒抽提外周血白細(xì)胞全基因組DNA,選擇常見的遺傳性心律失常綜合征致病基因作為候選基因,包括編碼鈉離子通道的SCN5A、SCN1B、SCN3B和GPA1L基因,編碼鉀離子通道的KCNQ1、KCNH2、KCNJ8、KCNE1、KCNE2和KCND3基因,編碼鈣離子通道的CACNA1C、CACNB2b和CACNA2D1基因以及編碼通道調(diào)節(jié)蛋白的ANK2和PRKAG2基因,設(shè)計(jì)相應(yīng)引物,使所測范圍涵蓋待測基因所有外顯子以及外顯子與內(nèi)含子交界區(qū)序列,采用DNA直接測序法(雙脫氧鏈終止法)進(jìn)行測序篩查基因變異,隨機(jī)選取本實(shí)驗(yàn)室DNA庫中400例相同遺傳背景及年齡性別匹配的正常健康人群標(biāo)本作為對照,以發(fā)現(xiàn)新的致病基因突變位點(diǎn)或單核苷酸多態(tài)性(single-nucleotide polymorphisms,SNPs)。5.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:所有涉及統(tǒng)計(jì)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS19.0軟件包統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤((?)±s)表示,兩組間比較采用t檢驗(yàn),多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA),P值0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P值0.01具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果:1.本研究收集到一個(gè)原因不明夜間猝死大家系,死者為包含先證者在內(nèi)的5名男性成員,先后在睡眠中發(fā)生猝死,均處青壯年時(shí)期,最小23歲,最大49歲,平均年齡34±8.4歲。2.先證者尸檢報(bào)告提示無機(jī)械性損傷、機(jī)械性窒息致死的法醫(yī)病理學(xué)改變,也無中毒致死的依據(jù);組織病理學(xué)檢查結(jié)果排外各主要器官器質(zhì)性病變,考慮猝死可能由心原性因素所致。所取心肌組織形態(tài)結(jié)構(gòu)及排列均正常,可排外心肌病等各種結(jié)構(gòu)性心臟病以及可伴右室心肌病變的Brugada綜合征。先證者死前3年內(nèi)偶發(fā)頭暈、心悸,無胸悶、胸痛及暈厥;既往心臟彩超檢查無明顯異常,24小時(shí)3導(dǎo)聯(lián)動(dòng)態(tài)心電圖記錄II導(dǎo)聯(lián)和a VF導(dǎo)聯(lián)J點(diǎn)抬高"g1.5mm。3.其他家庭成員既往史及個(gè)人史無特殊,無陽性體征,靜息心電圖、心臟彩超及平板運(yùn)動(dòng)試驗(yàn)檢查未見明顯異常。24 h動(dòng)態(tài)心電圖檢查發(fā)現(xiàn)3位家庭成員有ER表現(xiàn)。其中先證者弟弟ER表現(xiàn)最為顯著,下壁II、III和a VF導(dǎo)聯(lián),胸前V3~V5導(dǎo)聯(lián)J點(diǎn)抬高0.05 m V~0.3 m V,且可見J波,V2~V4導(dǎo)聯(lián)T波高尖。先證者兒子及其弟弟女兒的動(dòng)態(tài)心電圖表現(xiàn)為下壁和側(cè)壁導(dǎo)聯(lián)ST段抬高。4.通過候選基因測序篩查發(fā)現(xiàn)該家系1個(gè)鈣離子通道α1亞單位編碼基因CACNA1C的雜合錯(cuò)義突變,由第48號(hào)外顯子上第5747號(hào)堿基A轉(zhuǎn)換為堿基G,導(dǎo)致第1916位谷氨酰胺變?yōu)榫�氨�?即p.Q1916R。該突變見于先證者及源于父系的所有一級和二級親屬,而其母親及母親的兄弟姐妹和其他與先證者無血緣關(guān)系的家庭成員均不存在此突變。此外,在家系中還篩查到已被報(bào)道的5個(gè)CACNA1C基因SNPs,分別為c.2436CT(p.D812D),c.3786CT(p.F1262F),c.5361GA(p.T1787T),c.5609CT(p.T1870M)和c.5649GA(p.P1883P),以及1個(gè)SCN5A基因SNPs,c.3578GA(p.R1193Q)。5.CACNA1C-Q1916R突變攜帶者中有ER表現(xiàn)和無ER表現(xiàn)成員心電圖參數(shù)比較結(jié)果顯示,有ER表現(xiàn)成員的心率校正QT間期比無ER表現(xiàn)的成員短,但均在正常范圍,QT間期離散度(QT dispersion,QTd)和Tp-Te間期離散度(Tp-Te dispersion,Tp-ed)則更大,但兩組間各參數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論:1.本研究從一個(gè)青壯年男性SCD高發(fā)大家系,揭示SCD可能與ERS相關(guān)。2.ERS致病基因CACNA1C-Q1916R新突變可能與該家系ERS致SCD相關(guān)。3.CACNA1C-Q1916R突變攜帶家庭成員中ER呈不完全外顯性,考慮與SCN5A-R1193Q和性別相關(guān)。4.ER家庭成員心電圖中有致惡性心律失常性作用的復(fù)極化跨壁離散度參數(shù)指標(biāo)QTd和Tp-ed增大,但與無ER表現(xiàn)的CACNA1C突變攜帶成員比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,樣本量有限是可能原因。5.其它所發(fā)現(xiàn)的CACNA1C基因SNPs(D812D、F1262F、T1787T、T1870M和P1883P)無明顯致SCD效應(yīng)。第二部分CACNA1C基因突變致心原性猝死相關(guān)ER的分子遺傳學(xué)、細(xì)胞電生理機(jī)制及藥物干預(yù)探討目的:從組織和細(xì)胞水平探討CACNA1C-Q1916R突變的功能變化及致SCD相關(guān)ER的分子機(jī)理,并篩選有效的治療藥物。方法:1.人心肌組織標(biāo)本免疫組化:取攜帶CACNA1C基因突變先證者左心室肌組織,通過免疫組化法對組織內(nèi)由CACNA1C基因翻譯的Cav1.2蛋白表達(dá)及定位進(jìn)行檢測,并以成年人正常左心室標(biāo)本作為對照。2.CACNA1C-Q1916R定點(diǎn)突變:采用經(jīng)典的定點(diǎn)突變技術(shù),將CACAN1C基因第5747位堿基A突變?yōu)閴A基G,進(jìn)行測序驗(yàn)證并排除其它位點(diǎn)突變。3.CACNA1C質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染:采用Lipofectamine?2000轉(zhuǎn)染試劑盒,將攜帶野生和突變型CACNA1C,以及野生型CACNB2b和CACNA2D1基因的質(zhì)粒載體按摩爾濃度1:1:1分兩組共轉(zhuǎn)染入人胚腎293細(xì)胞(human embryonic kidney293,HEK293)中用于后續(xù)實(shí)驗(yàn),用于膜片鉗細(xì)胞電生理實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞則按0.3比例額外轉(zhuǎn)染表達(dá)綠色熒光的p EGFP-N3質(zhì)粒。4.實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Quantitative Real time PCR,q RT-PCR):采用q RT-PCR引物擴(kuò)增表達(dá)野生和突變型CACNA1C的HEK293細(xì)胞中CACNA1C的序列片段,檢測突變對Cav1.2總m RNA表達(dá)的影響。5.蛋白免疫印跡(Western Blot):采用Western Blot檢測表達(dá)野生和突變型CACNA1C的HEK293細(xì)胞中,Cav1.2在細(xì)胞總蛋白、膜蛋白和漿蛋白各水平的表達(dá)情況。6.細(xì)胞免疫熒光:在共聚焦熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染野生和突變型CACNA1C并經(jīng)Cav1.2特異抗體熒光染色的HEK293細(xì)胞,檢測突變對Cav1.2表達(dá)定位及轉(zhuǎn)運(yùn)的影響。7.全細(xì)胞膜片鉗細(xì)胞電生理分析及藥物篩選:采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄表達(dá)突變型CACNA1C的HEK293細(xì)胞上L型鈣離子流變化,以及雄激素睪酮(10μM)對其的影響。再分別加入ER治療藥物異丙腎上腺素(10μM)和奎尼丁(5μM),觀察藥物對鈣離子流的影響,繪制電流-電壓(I-V)曲線,電壓依賴的穩(wěn)態(tài)激活曲線(steady state activation,SSA)和電壓依賴的穩(wěn)態(tài)失活曲線(steady state inactivation,SSI)。8.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:所有涉及統(tǒng)計(jì)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS19.0軟件包統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤((?)±s)表示,兩組間比較采用t檢驗(yàn),多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA),P值0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P值0.01具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果:1.成功誘導(dǎo)CACNA1C-Q1916R突變,經(jīng)測序驗(yàn)證CACAN1C基因第5747位堿基A突變?yōu)閴A基G,其它位點(diǎn)未發(fā)生突變。2.免疫組化結(jié)果顯示攜帶CACNA1C基因突變的先證者心室肌組織Cav1.2蛋白表達(dá)水平低于正常對照組織(*P0.05),異源性表達(dá)突變Cav1.2的總m RNA表達(dá)水平較野生型Cav1.2低(*P0.01),且在細(xì)胞總蛋白、模蛋白和漿蛋白各水平的表達(dá)均下降(*P0.05)。3.細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示突變型Cav1.2蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)功能正常,但整體熒光強(qiáng)度更弱。4.全細(xì)胞膜片鉗結(jié)果顯示突變組鈣電流密度較野生組顯著降低,降低有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(*P0.05,**P0.01),SSA和SSI兩組間無差異;睪酮(10μM)可顯著降低突變組電流密度,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(#P0.05);ERS治療藥物異丙腎上腺素(10μM)可增加野生型鈣電流密度,對突變型鈣電流的增加無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,可引起野生型和突變型鈣電流的電壓依賴性SSA均發(fā)生左移;奎尼丁(5μM)對野生型和突變型鈣電流的幅度、密度和電壓依賴性SSA均無任何影響。結(jié)論:1.CACNA1C-Q1916R為功能喪失性突變,可使Cav1.2在m RNA和蛋白質(zhì)水平表達(dá)量均降低,但不影響蛋白的定位及轉(zhuǎn)運(yùn),突變可能通過減少細(xì)胞膜上有效Cav1.2數(shù)量而降低鈣電流。2.CACNA1C-Q1916R突變是引起本研究家系中ER表現(xiàn)及SCD的主要原因。3.睪酮加劇CACNA1C-Q1916R突變鈣電流密度減小,證實(shí)男性是突變攜帶成員發(fā)生SCD和ER表現(xiàn)的重要危險(xiǎn)因素。4.異丙腎上腺素可能對有ER表現(xiàn)及SCD高危的CACNA1C-Q1916R突變攜帶者有一定療效。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R541.78

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 賈學(xué)海,孫福成,何青,鄧開伯;78例老年人心原性猝死的臨床分析[J];現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志;2000年17期

2 呂林章,梁衍舜;聯(lián)合胸腹按壓對心原性猝死病人的搶救價(jià)值[J];社區(qū)醫(yī)學(xué)雜志;2003年03期

3 魯乃浩;孫小葆;;成功救治心原性猝死的幾點(diǎn)體會(huì)[J];中國廠礦醫(yī)學(xué);2006年03期

4 周向東;;上午增加心原性猝死發(fā)生率的流行病學(xué)調(diào)查[J];國外醫(yī)學(xué)(內(nèi)科學(xué)分冊);1991年12期

5 王忠良;老年心原性猝死的臨床與病理[J];實(shí)用老年醫(yī)學(xué);1997年02期

6 張雪峰,石淑慧,王久亮;老年心原性猝死60例臨床分析[J];實(shí)用老年醫(yī)學(xué);1999年01期

7 閆建玲,崔金榮,杜壽龍;心原性猝死45例臨床分析[J];中國廠礦醫(yī)學(xué);1999年06期

8 董都選,劉錄堂,石萍霞,李允利,田三虎;44例心原性猝死的心臟病理形態(tài)觀察分析[J];陜西醫(yī)學(xué)雜志;2001年04期

9 王曉君;王立山;王長印;;心原性猝死的危險(xiǎn)因素和預(yù)測[J];中國社區(qū)醫(yī)師;1990年06期

10 李滌臣，張銓澤;心原性猝死（附10例尸檢報(bào)告）[J];蚌埠醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);1994年01期

相關(guān)會(huì)議論文 前1條

1 陳德芳;李星;曹明芳;;4811例心電圖J波分析[A];第十三次全國心血管病學(xué)術(shù)會(huì)議論文集[C];2011年

相關(guān)重要報(bào)紙文章 前1條

1 本報(bào)記者 張林軍;關(guān)愛自己更要愛自己的心[N];大眾科技報(bào);2007年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 劉欣;鈣通道CACNA1C基因突變致心原性猝死相關(guān)早期復(fù)極的分子遺傳學(xué)機(jī)制探討[D];南昌大學(xué);2017年

，

本文編號(hào)：1408968