發(fā)布時(shí)間：2018-01-12 12:22

  本文關(guān)鍵詞：鵝膏肽類(lèi)毒素檢測(cè)方法建立及其在鵝膏菌屬中分布研究　出處：《中國(guó)疾病預(yù)防控制中心》2017年博士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

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【摘要】：蘑菇中毒導(dǎo)致的死亡占我國(guó)食物中毒死亡的35.6%,其中鵝膏菌屬占約90%。肽類(lèi)毒素是鵝膏菌屬中導(dǎo)致肝臟損傷和致死的主要毒素。雖然有毒蘑菇的發(fā)現(xiàn)及其毒素確證對(duì)病因溯源、中毒救治和健康教育都具有十分重要的意義。但目前能夠?qū)Χ灸⒐街卸景咐�中致病毒素展開(kāi)研究,對(duì)病因正確溯源的卻很少。這是由于:1、缺乏準(zhǔn)確可靠的鵝膏毒肽檢測(cè)方法,導(dǎo)致毒蘑菇毒素含量和構(gòu)成的數(shù)據(jù)常常相互矛盾;2、對(duì)鵝膏菌屬毒素含量及分布及動(dòng)態(tài)變化規(guī)律不了解,難以評(píng)估健康風(fēng)險(xiǎn);3、由于缺乏人體生物樣本快速、簡(jiǎn)單、高通量檢測(cè)方法,當(dāng)無(wú)法獲得現(xiàn)場(chǎng)標(biāo)本時(shí),無(wú)法通過(guò)病人體液生物樣本確定致病毒素;4、由于天然毒素的化學(xué)結(jié)構(gòu)多樣性,未知鵝膏毒肽結(jié)構(gòu)類(lèi)似物可存在健康風(fēng)險(xiǎn),仍需要不斷探索。因此,本研究以中毒致死率最高的鵝膏肽類(lèi)毒素為研究對(duì)象,1、建立蘑菇子實(shí)體中鵝膏肽類(lèi)毒素準(zhǔn)確可靠的檢測(cè)方法,為可疑毒蘑菇的毒素確證提供依據(jù);2、建立人體生物樣本中鵝膏肽類(lèi)毒素準(zhǔn)確可靠的檢測(cè)方法,為中毒早期臨床診斷提支持;3、研究種屬差異、組織部位、生長(zhǎng)過(guò)程對(duì)鵝膏肽類(lèi)毒素的分布影響;4、基于高分辨質(zhì)譜,建立鵝膏肽類(lèi)毒素非靶向篩查方法的建立并在劇毒鵝膏中篩查未知毒素,發(fā)現(xiàn)未知風(fēng)險(xiǎn),并建立篩查數(shù)據(jù)庫(kù)。1.蘑菇子實(shí)體中鵝膏肽類(lèi)毒素的同時(shí)測(cè)定的UPLC-MS/MS方法目前,我國(guó)蘑菇中毒事件處理和患者救治中很少進(jìn)行毒素檢測(cè)。已開(kāi)展研究中,對(duì)我國(guó)有毒鵝膏毒素成分組成、含量及分布規(guī)律了解有限,且時(shí)常相互矛盾。這有可能是毒素在種屬間、組織部位和生長(zhǎng)發(fā)育階段分布差異造成的,也可能是檢測(cè)方法帶來(lái)的誤差造成的。因此本研究建立了準(zhǔn)確可靠的蘑菇子實(shí)體中鵝膏肽類(lèi)毒素的LC-MS/MS檢測(cè)方法。該方法采用稀釋后直接進(jìn)樣方式,大大簡(jiǎn)化了樣品前處理步驟,并有效控制了基質(zhì)效應(yīng)。方法學(xué)驗(yàn)證數(shù)據(jù)和實(shí)際樣品應(yīng)用證明該方法穩(wěn)定、可靠、準(zhǔn)確,能夠滿(mǎn)足毒素含量范圍較大的鵝膏樣品檢測(cè)需求。2.生物樣品中鵝膏肽類(lèi)毒素的同時(shí)測(cè)定的UPLC-MS/MS方法在鵝膏菌中毒的救治中,早期正確診斷對(duì)病人的成功救治十分重要。因此需要建立人體生物樣本中鵝膏毒肽(amatoxin)和鬼筆毒肽(phallotoxin)的快速毒素確證和定量方法。因此本研究建立了 a-amanitin,β-amanitin,γ-amanitin,phalloidin(PHD)和 phallacidin(PCD)在人體血漿、血清、尿液中的 LC-MS/MS同時(shí)測(cè)定方法。應(yīng)用PRiME和μElution技術(shù)實(shí)現(xiàn)了高通量、快速、簡(jiǎn)單的樣品凈化,并優(yōu)化了 UPLC-MS/MS方法進(jìn)行檢測(cè)。經(jīng)完整的方法學(xué)驗(yàn)證,該方法具有滿(mǎn)意的靈敏度、準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性,適用于毒理學(xué)和臨床應(yīng)急檢測(cè)。在2015年云南發(fā)生的多起毒蘑菇中毒事件中,利用該方法發(fā)現(xiàn)兩例陽(yáng)性病例,為病因確證提供了數(shù)據(jù)支持。3.鵝膏肽類(lèi)毒素在鵝膏子實(shí)體中的分布研究本研究利用2012-2016年采集的鵝膏菌標(biāo)本,對(duì)鵝膏菌屬中主要毒素進(jìn)行了分析,初步闡明鵝膏菌種屬間毒素含量和組成存在很大差異。假淡紅鵝膏(Amanita subpallidorosea)是本研究團(tuán)隊(duì)首次鑒定明確并發(fā)表的我國(guó)劇毒新種,本研究以假淡紅鵝膏為代表系統(tǒng)分析了其組織部位、生長(zhǎng)發(fā)育階段對(duì)毒素含量分布的影響,發(fā)現(xiàn)毒素含量在不同組織和發(fā)育階段變化很大。揭示鵝膏毒肽含量和分布是一個(gè)動(dòng)態(tài)的過(guò)程,該研究對(duì)認(rèn)識(shí)生物毒素變化規(guī)律提供了新啟示。4.基于高分辨質(zhì)譜的鵝膏肽類(lèi)毒素非靶向篩查方法和篩查數(shù)據(jù)庫(kù)的建立本研究探索了發(fā)現(xiàn)蘑菇中潛在新毒素的篩查策略,利用高分辨質(zhì)譜PRM與AIF相結(jié)合的模式,建立了基于特征碎片的毒素篩查方法,并初步建立了特征碎片數(shù)據(jù)庫(kù)。在6個(gè)劇毒鵝膏樣品中發(fā)現(xiàn)了 11個(gè)環(huán)肽類(lèi)毒素,其中4個(gè)鑒定為amaninamide、phallisacin、Alal-viroidin 和 viroidin,其他 7 個(gè)為新化合物。該研究為未知毒素進(jìn)一步分離和確認(rèn),以及毒性和生物代謝產(chǎn)物合成通路研究研究提供了研究基礎(chǔ)。通過(guò)本研究初步建立了基于離子碎片的鵝膏肽類(lèi)毒素篩查庫(kù),并通過(guò)開(kāi)放和可擴(kuò)展的的數(shù)據(jù)庫(kù)工作流程,實(shí)現(xiàn)新化合物的循環(huán)擴(kuò)增。本研究首次在鱗柄鵝膏以外的種屬中發(fā)現(xiàn)了 virotoxin類(lèi)化合物,且含量很高。這一全新發(fā)現(xiàn)打破了對(duì)virotoxin的傳統(tǒng)認(rèn)知,并為從分類(lèi)學(xué)角度確定假淡紅鵝膏和鱗柄鵝膏的親緣關(guān)系提供了線索。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)疾病預(yù)防控制中心
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：R155.3

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