發(fā)布時間：2018-01-12 12:22

  本文關(guān)鍵詞：鵝膏肽類毒素檢測方法建立及其在鵝膏菌屬中分布研究　出處：《中國疾病預(yù)防控制中心》2017年博士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：蘑菇中毒導致的死亡占我國食物中毒死亡的35.6%,其中鵝膏菌屬占約90%。肽類毒素是鵝膏菌屬中導致肝臟損傷和致死的主要毒素。雖然有毒蘑菇的發(fā)現(xiàn)及其毒素確證對病因溯源、中毒救治和健康教育都具有十分重要的意義。但目前能夠?qū)Χ灸⒐街卸景咐�中致病毒素展開研究,對病因正確溯源的卻很少。這是由于:1、缺乏準確可靠的鵝膏毒肽檢測方法,導致毒蘑菇毒素含量和構(gòu)成的數(shù)據(jù)常常相互矛盾;2、對鵝膏菌屬毒素含量及分布及動態(tài)變化規(guī)律不了解,難以評估健康風險;3、由于缺乏人體生物樣本快速、簡單、高通量檢測方法,當無法獲得現(xiàn)場標本時,無法通過病人體液生物樣本確定致病毒素;4、由于天然毒素的化學結(jié)構(gòu)多樣性,未知鵝膏毒肽結(jié)構(gòu)類似物可存在健康風險,仍需要不斷探索。因此,本研究以中毒致死率最高的鵝膏肽類毒素為研究對象,1、建立蘑菇子實體中鵝膏肽類毒素準確可靠的檢測方法,為可疑毒蘑菇的毒素確證提供依據(jù);2、建立人體生物樣本中鵝膏肽類毒素準確可靠的檢測方法,為中毒早期臨床診斷提支持;3、研究種屬差異、組織部位、生長過程對鵝膏肽類毒素的分布影響;4、基于高分辨質(zhì)譜,建立鵝膏肽類毒素非靶向篩查方法的建立并在劇毒鵝膏中篩查未知毒素,發(fā)現(xiàn)未知風險,并建立篩查數(shù)據(jù)庫。1.蘑菇子實體中鵝膏肽類毒素的同時測定的UPLC-MS/MS方法目前,我國蘑菇中毒事件處理和患者救治中很少進行毒素檢測。已開展研究中,對我國有毒鵝膏毒素成分組成、含量及分布規(guī)律了解有限,且時常相互矛盾。這有可能是毒素在種屬間、組織部位和生長發(fā)育階段分布差異造成的,也可能是檢測方法帶來的誤差造成的。因此本研究建立了準確可靠的蘑菇子實體中鵝膏肽類毒素的LC-MS/MS檢測方法。該方法采用稀釋后直接進樣方式,大大簡化了樣品前處理步驟,并有效控制了基質(zhì)效應(yīng)。方法學驗證數(shù)據(jù)和實際樣品應(yīng)用證明該方法穩(wěn)定、可靠、準確,能夠滿足毒素含量范圍較大的鵝膏樣品檢測需求。2.生物樣品中鵝膏肽類毒素的同時測定的UPLC-MS/MS方法在鵝膏菌中毒的救治中,早期正確診斷對病人的成功救治十分重要。因此需要建立人體生物樣本中鵝膏毒肽(amatoxin)和鬼筆毒肽(phallotoxin)的快速毒素確證和定量方法。因此本研究建立了 a-amanitin,β-amanitin,γ-amanitin,phalloidin(PHD)和 phallacidin(PCD)在人體血漿、血清、尿液中的 LC-MS/MS同時測定方法。應(yīng)用PRiME和μElution技術(shù)實現(xiàn)了高通量、快速、簡單的樣品凈化,并優(yōu)化了 UPLC-MS/MS方法進行檢測。經(jīng)完整的方法學驗證,該方法具有滿意的靈敏度、準確性和穩(wěn)定性,適用于毒理學和臨床應(yīng)急檢測。在2015年云南發(fā)生的多起毒蘑菇中毒事件中,利用該方法發(fā)現(xiàn)兩例陽性病例,為病因確證提供了數(shù)據(jù)支持。3.鵝膏肽類毒素在鵝膏子實體中的分布研究本研究利用2012-2016年采集的鵝膏菌標本,對鵝膏菌屬中主要毒素進行了分析,初步闡明鵝膏菌種屬間毒素含量和組成存在很大差異。假淡紅鵝膏(Amanita subpallidorosea)是本研究團隊首次鑒定明確并發(fā)表的我國劇毒新種,本研究以假淡紅鵝膏為代表系統(tǒng)分析了其組織部位、生長發(fā)育階段對毒素含量分布的影響,發(fā)現(xiàn)毒素含量在不同組織和發(fā)育階段變化很大。揭示鵝膏毒肽含量和分布是一個動態(tài)的過程,該研究對認識生物毒素變化規(guī)律提供了新啟示。4.基于高分辨質(zhì)譜的鵝膏肽類毒素非靶向篩查方法和篩查數(shù)據(jù)庫的建立本研究探索了發(fā)現(xiàn)蘑菇中潛在新毒素的篩查策略,利用高分辨質(zhì)譜PRM與AIF相結(jié)合的模式,建立了基于特征碎片的毒素篩查方法,并初步建立了特征碎片數(shù)據(jù)庫。在6個劇毒鵝膏樣品中發(fā)現(xiàn)了 11個環(huán)肽類毒素,其中4個鑒定為amaninamide、phallisacin、Alal-viroidin 和 viroidin,其他 7 個為新化合物。該研究為未知毒素進一步分離和確認,以及毒性和生物代謝產(chǎn)物合成通路研究研究提供了研究基礎(chǔ)。通過本研究初步建立了基于離子碎片的鵝膏肽類毒素篩查庫,并通過開放和可擴展的的數(shù)據(jù)庫工作流程,實現(xiàn)新化合物的循環(huán)擴增。本研究首次在鱗柄鵝膏以外的種屬中發(fā)現(xiàn)了 virotoxin類化合物,且含量很高。這一全新發(fā)現(xiàn)打破了對virotoxin的傳統(tǒng)認知,并為從分類學角度確定假淡紅鵝膏和鱗柄鵝膏的親緣關(guān)系提供了線索。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：中國疾病預(yù)防控制中心
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R155.3

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本文編號：1414241