發(fā)布時間：2018-01-12 15:26

  本文關鍵詞：化瘀丸對4T1乳腺癌生長轉移的干預作用及其基于血小板途徑的抗腫瘤機制的研究　出處：《北京中醫(yī)藥大學》2017年博士論文　論文類型：學位論文

  更多相關文章： 化瘀丸 姜黃素 4T1乳腺癌 腫瘤轉移 高凝狀態(tài) 血小板

【摘要】：研究背景:乳腺癌是世界范圍內女性最好發(fā)的惡性腫瘤,并且是女性癌因性死亡的第二大疾病。引發(fā)患者死亡的最主要原因是腫瘤細胞的轉移。最新的研究發(fā)現(xiàn)許多惡性腫瘤患者會出現(xiàn)血液高凝狀態(tài),這種血液高凝狀態(tài)會增加患者轉移和術后復發(fā)的風險�？v觀腫瘤微環(huán)境,血小板在形成血液高凝狀態(tài)和促進腫瘤血行轉移中發(fā)揮著重要作用。活化的血小板可以與腫瘤細胞形成復合物,保護血管中的腫瘤細胞免于被高剪切血流和宿主免疫系統(tǒng)消除,這將有利于腫瘤細胞粘附到血管的內皮細胞并外滲。此外,腫瘤細胞可以刺激血小板活化,腫瘤細胞表面和血小板細胞膜上的整合蛋白integrins以受體和配體的形式相結合,促進腫瘤細胞和血小板之間的粘附。整合蛋白是由在血小板中大量表達的非共價連接的α和β亞基組成的跨膜粘附受體家族。在乳腺癌中,β 3和β1整合蛋白的表達已經被研究證實支持血小板與腫瘤細胞的相互作用,允許腫瘤細胞粘附到脈管系統(tǒng)并由此轉移。因此,下調血小板活化可能是緩解血液高凝狀態(tài)和抑制腫瘤轉移的有效策略。目前的抗血小板藥物如肝素和阿司匹林被證實是通過消耗全身血小板來顯示出對腫瘤轉移的治療功效。然而,這種治療策略具有臨床局限性,因為這一治療策略與一些并發(fā)癥例如胃腸出血和出血性中風相關,特別是在由于化療或放射治療已經出現(xiàn)血小板減少的患者中。因此,應該研究更安全同時保證有效的抗血小板藥。化瘀丸是以"益氣活血解毒"為治則組成的中藥方劑,用于防治惡性腫瘤,并在臨床中顯示出抗腫瘤效果�；�瘀丸的藥理學研究顯示,姜黃素是化瘀丸中單體成分之一。從植物中提取的姜黃素是對人沒有顯著毒性的自然界的化合物,并已應用在各種病癥的防治中。越來越多的證據(jù)表明姜黃素是一種高度多效的分子,具有不同的生物活性。雖然廣泛的研究表明姜黃素具有抗腫瘤作用,但其抗轉移效能和基礎機制幾乎沒有報告。實驗方法:體外實驗:我們采用MTT法、ECIS細胞動態(tài)分析儀來研究中藥復方化瘀丸、中藥單體姜黃素對4T1乳腺癌細胞增殖的影響。劃痕實驗和電擊損傷修復實驗檢測HYW含藥血清、姜黃素對4T1乳腺癌細胞遷移、損傷修復能力的影響。采用Western blot的方法檢測在4T1細胞總蛋白中MAPK信號通路和PI3K信號通路蛋白的表達量。體內實驗:建立乳腺癌原位移植瘤小鼠模型,分別給予化瘀丸、姜黃素口服干預,檢測腫瘤體積、重量、生物發(fā)光情況,并檢測肺轉移灶的面積、個數(shù),肺重,來觀察化瘀丸及姜黃素對原位瘤和轉移瘤的干預作用。凝血四項中檢測APTT、PT、Fbg,血小板計數(shù)來檢測治療后血小板個數(shù)的改變。血栓彈力圖檢測血小板功能。流式細胞術檢測血小板活化和凋亡。Western blot檢測腫瘤組織中整合蛋白integrins的表達。實驗結果:MTT法、ECIS細胞動態(tài)分析儀均證明HYW含藥血清、姜黃素對4T1細胞有增殖抑制作用,并且這種抑制作用呈現(xiàn)出劑量依賴和時間依賴。ECIS細胞電擊損傷實驗證實各濃度HYW含藥血清、Cur-luM組、Cur-1OuM組和Cur-30uM組姜黃素對4T1細胞的運動遷移能力有明顯的抑制作用。我們檢測了 MAPK通路中P38蛋白和ERK蛋白的表達,同時檢測了磷酸化的P38蛋白和磷酸化的ERK蛋白的表達,發(fā)現(xiàn)與空白對照組相比,化瘀丸組和姜黃素組的磷酸化的P38蛋白和磷酸化的ERK蛋白表達量明顯下降。我們檢測了 PI3K通路中PI3K蛋白和AKT蛋白的表達,同時檢測了磷酸化的PI3K蛋白和磷酸化的AKT蛋白的表達,與空白對照組相比,化瘀丸組和姜黃素組的磷酸化的PI3K蛋白和磷酸化的AKT蛋白表達量明顯下降。我們用4T1乳腺癌細胞和BALB/C小鼠建立了小鼠乳墊原位移植瘤模型,給予不同劑量化瘀丸和不同劑量姜黃素治療。小動物活體成像技術實驗結果表明連續(xù)給藥3周后,HYW-L與和HYW-H均能降低原位腫瘤的光子數(shù),然而,HYW-L只表現(xiàn)出抑制腫瘤生長的趨勢,并無統(tǒng)計學差異。HYW-H組對腫瘤的光子數(shù)的影響有統(tǒng)計學差異。犧牲小鼠取得腫瘤后,稱量腫瘤重量,結果與小動物成像儀所得結果相一致,HYW-H表現(xiàn)出良好的抑瘤效果。連續(xù)給藥21天,每周2次應用游標卡尺測量腫瘤長徑(length)和短徑(width),按照公式計算腫瘤體積。根據(jù)腫瘤體積繪制生長曲線,隨給藥時間的延續(xù)動態(tài)觀察各組小鼠腫瘤體積的變化趨勢。HYW-L組和HYW-H組原位腫瘤的瘤體積的增長持續(xù)低于模型組。犧牲小鼠后取小鼠完整肺臟,稱重記錄,治療組肺重低于模型組,肺轉移灶面積和肺轉移灶個數(shù)低于模型組。HYW組和Cur組治療后PLT并未發(fā)現(xiàn)改變。模型組小鼠和正常小鼠相比,PT明顯下降,表明乳腺癌荷瘤小鼠血液處于高凝狀態(tài)。經過化瘀丸、姜黃素治療后,荷瘤小鼠PT上升,與模型組相比有明顯差異。模型組小鼠和正常小鼠相比,APPT明顯下降,表明乳腺癌荷瘤小鼠血液處于高凝狀態(tài)。經過化瘀丸、姜黃素分別治療后,荷瘤小鼠APPT上升,并且APTT的上升隨著姜黃素劑量的增加而增加。血栓彈力圖結果顯示,與正常小鼠相比,負荷腫瘤的小鼠顯示出較短的R時間,表明血凝過快,有統(tǒng)計學差異(P0.05)。與對照組相比,化瘀丸、姜黃素治療組的R時間增加。MA值振幅的成對比較顯示正常組和對照組之間的顯著差異(P0.05)。通過呈現(xiàn)高MA值,我們在荷瘤小鼠中觀察到血小板功能亢進導致的高凝狀態(tài)。用不同濃度的化瘀丸、姜黃素治療,結果顯示化瘀丸、姜黃素可以以劑量依賴的方式降低荷瘤小鼠血液中血小板的功能亢進。通過流式細胞術分析,我們發(fā)現(xiàn)化瘀丸、姜黃素可以在很大程度上抑制血小板中的P-選擇素表達。用不同濃度的化瘀丸,姜黃素治療腫瘤負荷的小鼠,導致凋亡的血小板比例以劑量依賴性方式增加。化瘀丸及其單體成分姜黃素對腫瘤組織中與細胞粘附分子相關的整合蛋白integrin β1 和 integrin β3 有下調作用。結論:體內實驗證實化瘀丸及其單體成分姜黃素能有效地抑制乳腺癌4T1細胞的增殖和轉移。體內試驗證實化瘀丸及其單體成分姜黃素有效地緩解了乳腺癌荷瘤小鼠的血液高凝狀態(tài),原位腫瘤和肺轉移也得到了一定程度的抑制。進一步探索機制,化瘀丸及姜黃素通過降低血液高凝狀態(tài),抑制血小板活化,下調β1和β3整聯(lián)蛋白的表達,減弱腫瘤細胞和血小板之間的相互作用,從而抑制腫瘤轉移。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：北京中醫(yī)藥大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R285

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本文編號：1414843