發(fā)布時(shí)間：2018-01-12 19:01

  本文關(guān)鍵詞：BCL2L10抑制肝細(xì)胞癌生長與轉(zhuǎn)移的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究　出處：《河北醫(yī)科大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

  更多相關(guān)文章： 肝細(xì)胞癌 BCL2L10 腫瘤抑制 增殖 凋亡 轉(zhuǎn)移 血管生成

【摘要】：肝細(xì)胞癌(HEpatocellular carcinoma,HCC)是世界上五大常見的惡性腫瘤之一,發(fā)病率居全球第6位,位列腫瘤相關(guān)死亡原因的第3位。其起病隱匿,往往進(jìn)展至晚期階段才被發(fā)現(xiàn)。HCC發(fā)生發(fā)展的生物學(xué)機(jī)制仍不清楚,目前手術(shù)切除是治療HCC唯一有效方法,但切除術(shù)后的高轉(zhuǎn)移率和高復(fù)發(fā)率嚴(yán)重影響其預(yù)后。因此對HCC的發(fā)病機(jī)制研究一直是全球研究的熱點(diǎn),其過程是多因素多階段多基因變異共同作用的病理過程。研究表明,細(xì)胞凋亡和增殖貫穿于其發(fā)生發(fā)展的全過程,涉及多種抑制細(xì)胞凋亡的基因高度表達(dá)、異常激活及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的抗癌基因異常失活。目前認(rèn)為,細(xì)胞凋亡抑制在HCC的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。BCL2L10(Bcl2-like-10)是在分離新型BCL-2同源基因時(shí)被發(fā)現(xiàn)的由204個(gè)氨基酸組成的多肽,蛋白質(zhì)分子量23kDa。BCL2L10屬于BCL-2家族成員,廣泛表達(dá)于人類組織中。BCL-2家族是進(jìn)化上保守的細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵性調(diào)節(jié)者,其通過促凋亡或抗凋亡在正常胚胎發(fā)育、組織內(nèi)穩(wěn)態(tài)和多種病理狀態(tài)下發(fā)揮不可替代的作用。根據(jù)對細(xì)胞凋亡的影響B(tài)CL-2家族分為兩類:抗凋亡家族成員和促凋亡家族成員,前者抗凋亡的作用受后者的拮抗。作為BCL-2家族中最晚被鑒定出來的成員,BCL2L10 mRNA在正常人骨髓、肝臟、腦、肺組織中表達(dá)量較高。最初認(rèn)為BCL2L10與BCL-2一樣同屬于抗凋亡家族成員。有研究發(fā)現(xiàn)在乳腺癌、前列腺癌、胃癌、結(jié)腸腺癌和非小細(xì)胞肺癌中BCL2L10腫瘤特異性表達(dá)上調(diào)。然而最近有研究報(bào)道,與非癌胃粘膜組織相比BCL2L10在胃癌組織中表達(dá)下調(diào),過表達(dá)BCL2L10可促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡、抑制其增殖,發(fā)現(xiàn)BCL2L10作為腫瘤抑制因子在胃癌發(fā)生中發(fā)揮重要作用�；�礎(chǔ)研究指出,BCL2L10這種在不同癌組織中發(fā)揮截然相反作用的能力,可能是由于其可根據(jù)不同的組織環(huán)境和細(xì)胞類型發(fā)揮出不同的作用有關(guān)。盡管有研究發(fā)現(xiàn)BCL2L10在正常人肝組織表達(dá)相對較高,但目前尚缺乏其在HCC中表達(dá)與作用的研究。為了闡明BCL2L10在HCC中的作用,本文中我們首先比較了BCL2L10在人HCC及其癌旁組織中的表達(dá)以及其在不同HCC細(xì)胞系及人正常肝細(xì)胞的表達(dá);其次通過與腫瘤增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移相關(guān)的體內(nèi)外功能實(shí)驗(yàn),發(fā)掘BCL2L10在HCC中的功能作用;最后應(yīng)用人類癌癥通路芯片及驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)探索BCL2L10在HCC作用的分子機(jī)制。第一部分BCL2L10在肝細(xì)胞癌組織及細(xì)胞中的表達(dá)目的:分析對比BCL2L10在人HCC組織及其癌旁組織中的表達(dá)以及其在不同HCC細(xì)胞系及人正常肝細(xì)胞的表達(dá)。方法:收集河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院肝膽外科2014-5至2015-6行外科手術(shù)治療的HCC患者的HCC組織及其癌旁組織42對。應(yīng)用realtimepcr檢測42對HCC患者HCC組織及癌旁組織中BCL2L10的表達(dá);BCL2L10mrna在HCC組織較其癌旁組織表達(dá)降低的30對標(biāo)本中應(yīng)用westernblot分析檢測BCL2L10蛋白的表達(dá)水平;應(yīng)用HE和免疫組化染色觀察BCL2L10在HCC及其癌旁組織中的表達(dá);應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄pcr(rt-pcr)及realtimepcr分別檢測BCL2L10mrna在HepG2、HEp3b、huh6、Huh7和smmc7721共5種HCC細(xì)胞系、正常人肝細(xì)胞lo2及1對HCC組織及配對癌旁組織中的表達(dá);應(yīng)用westernblot方法檢測BCL2L10蛋白在HepG2、Huh7、smmc7721共3種HCC細(xì)胞系、正常人肝細(xì)胞lo2、1對HCC組織及其配對的癌旁組織中的表達(dá)。結(jié)果:1在42對患者標(biāo)本中有30個(gè)HCC組織BCL2L10mrna表達(dá)水平明顯低于其配對的癌旁組織(30/42);在這30對標(biāo)本中HCC組織的BCL2L10蛋白表達(dá)水平明顯低于其配對的癌旁組織。2免疫組化染色顯示BCL2L10在癌旁組織中高表達(dá)呈棕黃色,主要表達(dá)于細(xì)胞漿,而在HCC組織中呈現(xiàn)低表達(dá)。3BCL2L10mrna在癌旁組織及l(fā)o2細(xì)胞中表達(dá)較高,而在HepG2、HEp3b、huh6、Huh7、smmc7721HCC細(xì)胞中表達(dá)較低,其中在HepG2、HEp3b、huh6、Huh7細(xì)胞中表達(dá)降低較明顯;BCL2L10蛋白在癌旁組織及l(fā)o2細(xì)胞中表達(dá)較高,而在HepG2、Huh7、smmc7721細(xì)胞中表達(dá)較低,其中在HepG2、Huh7細(xì)胞中表達(dá)降低較明顯。結(jié)論:BCL2L10在HCC組織及細(xì)胞中表達(dá)較癌旁組織及正常肝細(xì)胞降低。第二部分BCL2L10對肝細(xì)胞癌增殖、凋亡作用的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究目的:通過在體外HCC細(xì)胞中過表達(dá)或敲低BCL2L10,探討B(tài)CL2L10對HCC增殖及凋亡的影響,在體內(nèi)裸鼠成瘤試驗(yàn)中進(jìn)一步驗(yàn)證其對HCC生長的作用。方法:在人HCC細(xì)胞系HepG2和Huh7中過表達(dá)BCL2L10,在人HCC細(xì)胞系smmc7721中敲低BCL2L10;通過cck-8試驗(yàn)檢測細(xì)胞活力,克隆形成實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞增殖情況,流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期變化,westernblot檢測增殖標(biāo)志物pcna以及細(xì)胞周期蛋白cdc25c的表達(dá),觀察BCL2L10對HCC增殖的影響;通過annexinv/pi雙染染色檢測細(xì)胞凋亡比例,westernblot檢測半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3、8、9(caspase-3、caspase-8、caspase-9)表達(dá),評估BCL2L10對HCC凋亡的影響;裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)觀察BCL2L10過表達(dá)HepG2細(xì)胞對裸鼠皮下移植瘤生長的影響。結(jié)果:1在HepG2和Huh7細(xì)胞系中成功過表達(dá)BCL2L10,在smmc7721中成功敲低BCL2L10。應(yīng)用帶flag標(biāo)簽的BCL2L10過表達(dá)質(zhì)粒(gv141-BCL2L10)分別轉(zhuǎn)染HepG2和Huh7細(xì)胞,并以僅帶flag標(biāo)簽的空載體(gv141-control)作為對照,rt-pcr和westernblot結(jié)果顯示,兩種細(xì)胞BCL2L10組BCL2L10mrna和蛋白表達(dá)水平較control組均明顯上升,表明該質(zhì)粒在兩種細(xì)胞中均成功過表達(dá)BCL2L10。應(yīng)用靶向BCL2L10的sirna(si-BCL2L10)轉(zhuǎn)染smmc7721細(xì)胞,并轉(zhuǎn)染無關(guān)對照序列(si-control)作為對照,rt-pcr和westernblot結(jié)果顯示,與si-control組比較,si-BCL2L10組BCL2L10mrna和蛋白表達(dá)水平明顯下降,表明BCL2L10在smmc7721細(xì)胞中的表達(dá)被顯著抑制。2BCL2L10抑制HCC細(xì)胞增殖BCL2L10抑制HCC細(xì)胞生長活力。cck-8試驗(yàn)結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染過表達(dá)BCL2L10質(zhì)粒72h后,HepG2和Huh7兩種細(xì)胞系中,BCL2L10組細(xì)胞生存率較control組明顯降低。敲低BCL2L10后72hsmmc7721細(xì)胞中,敲低組smmc7721/si-BCL2L10細(xì)胞生存率較對照組smmc7721/si-control明顯增高。表明BCL2L10抑制HCC細(xì)胞生長活力。BCL2L10抑制HCC細(xì)胞克隆形成�？寺⌒纬山Y(jié)果顯示:HepG2/control組細(xì)胞克隆數(shù)為588.0±51.05,而轉(zhuǎn)染BCL2L10的HepG2/BCL2L10組細(xì)胞克隆數(shù)為230.7±35.96,明顯低于陰性對照組,且形成的克隆較小。Huh7/control組細(xì)胞克隆數(shù)為386.3±24.52,而轉(zhuǎn)染BCL2L10的Huh7/BCL2L10組細(xì)胞克隆數(shù)為153.0±29.57,明顯低于陰性對照組,且形成的克隆較小。表明過表達(dá)BCL2L10后的HCC細(xì)胞克隆形成能力降低。BCL2L10降低HCC細(xì)胞中pcna表達(dá)。westernblot分析結(jié)果顯示,過表達(dá)BCL2L10的HepG2和Huh7細(xì)胞中,BCL2L10組pcna相對表達(dá)水平明顯低于control組。表明BCL2L10可抑制HCC細(xì)胞增殖。BCL2L10阻滯了細(xì)胞周期。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示,HepG2細(xì)胞在轉(zhuǎn)染BCL2L10過表達(dá)質(zhì)粒48h后,與對照組相比,過表達(dá)組g2/m期細(xì)胞所占比例上升,s期細(xì)胞所占比例減少,g1期細(xì)胞比例無明顯變化;Huh7細(xì)胞在轉(zhuǎn)染BCL2L10過表達(dá)質(zhì)粒48h后,與對照組相比,過表達(dá)組g2/m期細(xì)胞所占比例上升,s期細(xì)胞所占比例減少,g1期細(xì)胞比例無明顯變化。表明過表達(dá)BCL2L10可將HepG2及Huh7細(xì)胞周期阻滯在g2/m期,從而抑制細(xì)胞有絲分裂,抑制細(xì)胞增殖。BCL2L10可降低細(xì)胞分裂周期蛋白cdc25c的表達(dá)。westernblot分析結(jié)果顯示,過表達(dá)BCL2L10的HepG2和Huh7兩種細(xì)胞中,BCL2L10組細(xì)胞分裂周期蛋白cdc25c相對表達(dá)水平明顯低于control組。表明BCL2L10可能通過抑制促分裂周期蛋白cdc25c的表達(dá)抑制細(xì)胞增殖。3BCL2L10促進(jìn)HCC細(xì)胞凋亡成功將BCL2L10在HepG2和Huh7細(xì)胞上過表達(dá)、在smmc7721細(xì)胞上敲低的基礎(chǔ)上,應(yīng)用流式細(xì)胞儀annexinv/pi雙染染色檢測細(xì)胞凋亡比例,結(jié)果顯示在HepG2和Huh7細(xì)胞過表達(dá)BCL2L10組細(xì)胞凋亡比例較對照組明顯升高,在smmc7721細(xì)胞中敲低BCL2L10組細(xì)胞凋亡比例較對照組明顯降低;應(yīng)用westernblot檢測活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3、8、9(caspase-3、caspase-8、caspase-9)結(jié)果顯示,HepG2和Huh7細(xì)胞中過表達(dá)BCL2L10組caspase-3、caspase-8及caspase-9的表達(dá)均較對照組增加。4BCL2L10抑制HepG2細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤生長裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:BCL2L10過表達(dá)組裸鼠皮下移植瘤體積明顯小于對照組。結(jié)論:BCL2L10抑制HCC增殖,促進(jìn)其凋亡,抑制HCC生長。第三部分BCL2L10對肝細(xì)胞癌遷移、侵襲、血管生成作用的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究目的:應(yīng)用體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)評價(jià)BCL2L10在HCC遷移、侵襲、血管生成中的作用,探討B(tài)CL2L10在HCC轉(zhuǎn)移中的作用。方法:在成功過表達(dá)以及敲低BCL2L10的基礎(chǔ)上,應(yīng)用創(chuàng)傷愈合實(shí)驗(yàn)評估細(xì)胞遷移行為;應(yīng)用martrigel侵襲實(shí)驗(yàn)評估其對HepG2細(xì)胞侵襲的影響;應(yīng)用人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞血管形成實(shí)驗(yàn)觀察BCL2L10對HCC細(xì)胞血管形成作用的影響;對裸鼠皮下移植瘤組織行HE染色和cd34免疫組化染色,觀察BCL2L10對體內(nèi)移植瘤血管形成的影響;應(yīng)用裸鼠HCC肺轉(zhuǎn)移模型觀察BCL2L10在HCC轉(zhuǎn)移中的作用。結(jié)果:1BCL2L10抑制了HCC細(xì)胞遷移在HepG2、Huh7兩種過表達(dá)BCL2L10細(xì)胞系中,BCL2L10組較control組劃痕愈合明顯減慢。在smmc7721細(xì)胞中敲低BCL2L10后si-BCL2L10組較si-control組劃痕愈合速度加快。2BCL2L10明顯抑制了HepG2細(xì)胞的侵襲能力。3BCL2L10抑制HCC血管生成血管形成體外實(shí)驗(yàn):過表達(dá)BCL2L10組HepG2細(xì)胞的條件培養(yǎng)基較對照組明顯減少了血管內(nèi)皮細(xì)胞的血管形成能力,提示BCL2L10可抑制HCC的血管生成能力。血管形成體內(nèi)實(shí)驗(yàn):HE染色觀察BCL2L10過表達(dá)組HepG2細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)形成的皮下移植瘤血管數(shù)量少于對照組;cd34免疫組化染色分析顯示BCL2L10過表達(dá)組HepG2細(xì)胞形成的皮下移植瘤組織cd34陽性面積明顯小于對照組;提示BCL2L10抑制體內(nèi)HCC組織的血管生成能力。4BCL2L10抑制裸鼠HCC肺轉(zhuǎn)移HE染色發(fā)現(xiàn)空載體HepG2細(xì)胞注射組裸鼠肺轉(zhuǎn)移發(fā)生率為83.3%(5/6),而BCL2L10過表達(dá)HepG2細(xì)胞注射組裸鼠肺轉(zhuǎn)移發(fā)生率為33.3%(2/6),提示BCL2L10可抑制裸鼠體內(nèi)HCC肺轉(zhuǎn)移。結(jié)論:BCL2L10抑制HCC遷移、侵襲、血管生成,抑制HCC肺轉(zhuǎn)移。第四部分BCL2L10抑制肝細(xì)胞癌生長與轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制目的:探討B(tài)CL2L10抑制HCC的分子機(jī)制。方法:應(yīng)用BCL2L10過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞后采用人類癌癥通路pcr芯片分析其基因表達(dá)譜;應(yīng)用Western blot在蛋白水平驗(yàn)證相關(guān)基因的表達(dá)變化;結(jié)合全部四部分研究結(jié)果描繪出BCL2L10抑制HCC具體分子通路示意圖。結(jié)果:1與空載體組相比,BCL2L10過表達(dá)組細(xì)胞的相關(guān)基因表達(dá)有明顯變化,這些基因涉及到與腫瘤形成密切相關(guān)的細(xì)胞生長、凋亡、粘附、轉(zhuǎn)移、血管生成幾方面。其中,過表達(dá)BCL2L10后與對照組相比表達(dá)明顯增加的基因有:與細(xì)胞凋亡相關(guān)的tnf(2.5倍)、tnfrsf25(1.8倍)和tnfrsf10b(1.5倍),與細(xì)胞粘附相關(guān)的cdh11(4.8倍)、cdh1(1.5倍),與轉(zhuǎn)移抑制相關(guān)的基因timp2(20.9倍)、timp1(1.7倍);過表達(dá)BCL2L10后與對照組相比表達(dá)明顯降低的基因有:與細(xì)胞遷移相關(guān)的mmp9(-8.0倍)、mmp13(-13.1倍),與血管生成相關(guān)的vegfc(-3.3倍)。過表達(dá)BCL2L10后在所有檢測到有變化基因中,jak1表達(dá)變化最大,其表達(dá)較對照組下降了23倍。2Western blot結(jié)果顯示:過表達(dá)BCL2L10上調(diào)了CDH11、CDH1蛋白的表達(dá),分別下調(diào)了MMP9、VEGFC、p-LAK1 and p-STAT3蛋白的表達(dá)。3以上研究結(jié)果提示:BCL2L10可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移、血管生成抑制HCC的生長與轉(zhuǎn)移,在HCC發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮其腫瘤抑制作用。結(jié)論:1過表達(dá)BCL2L10可通過上調(diào)TNF、DR3、DR5、caspase-3、caspase-8、caspase-9、CDH1、CDH11、TIMP1、TIMP2表達(dá),下調(diào)PCNA、CDC25C、MMP9、MMP13、VEGFC表達(dá),實(shí)現(xiàn)其抑制HCC生長與轉(zhuǎn)移的作用。2 BCL2L10在HCC中可能通過抑制JAK1-STAT3通路激活發(fā)揮抗腫瘤作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R735.7

【參考文獻(xiàn)】

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1 ;Caspase Family Proteases and Apoptosis[J];Acta Biochimica et Biophysica Sinica;2005年11期

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本文編號：1415553