發(fā)布時間：2018-01-13 21:35

  本文關鍵詞：腫瘤激活的中性粒細胞通過GM-CSF-PD-L1通路抑制抗胃癌免疫并促進胃癌進展　出處：《第三軍醫(yī)大學》2017年博士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：胃癌是發(fā)展中國家癌癥相關死亡的首要原因之一。胃癌患者的預后很差,五年生存率低于30%。胃癌發(fā)生發(fā)展及轉歸與胃癌的免疫抑制性微環(huán)境密切相關。腫瘤微環(huán)境由腫瘤細胞及各種基質細胞共同組成,其中包括大量免疫細胞,這些免疫細胞構成了腫瘤的免疫微環(huán)境。中性粒細胞在實體瘤中大量浸潤,在不同腫瘤微環(huán)境中,其表現(xiàn)為不同的表型,發(fā)揮不同的功能。但是,目前還不清楚胃癌微環(huán)境中的中性粒細胞的表型、功能及其臨床意義。研究目的1.明確中性粒細胞在胃癌中的分布和表型特征;2.探討胃癌微環(huán)境對中性粒細胞的調控及其機制;3.明確中性粒細胞在胃癌中的功能及作用機制;4.從體內對中性粒細胞在胃癌中的功能及作用機制進行驗證,闡明胃癌激活中性粒細胞的臨床意義。研究方法1.中性粒細胞在胃癌中的分布和表型特征在重慶西南醫(yī)院普通外科收集胃癌病人新鮮外周血和不同類型胃組織標本(包括胃癌組織、癌旁組織及非腫瘤正常胃組織)。流式細胞術和免疫組織化學染色檢測中性粒細胞的分布情況;流式細胞術檢測中性粒細胞表型。2.胃癌微環(huán)境對中性粒細胞的調控及其調控機制分選健康成人外周血中性粒細胞,用20%、40%、50%或80%胃癌組織培養(yǎng)上清(TTCS)或50%正常胃組織培養(yǎng)上清(NTCS)刺激16h后,流式細胞術檢測中性粒細胞的凋亡情況。分選健康成人外周血中性粒細胞,用TTCS或NTCS刺激外周血中性粒細胞12h后,收集細胞用于流式染色,分析條件性中性粒細胞的表型�；�因芯片檢測胃癌組織中促炎因子表達情況。分選健康成人外周血中性粒細胞,用不同重組人細胞因子(GM-CSF,M-CSF,G-CSF,IFN-γ,TGF-β,IL-1β,IL-6,IL-17A,IL-23,IL-22,IL-10)刺激外周血中性粒細胞12h后,收集細胞用于流式染色,分析條件性中性粒細胞的表型。提取胃癌組織和正常胃組織蛋白,收集TTCS和NTCS,用ELISA試劑盒檢測其中的GM-CSF的濃度。取胃癌標本做石蠟切片,用免疫熒光雙染技術檢測GM-CSF與EP-CAM的共表達情況。分選健康成人外周血中性粒細胞,分別用不同信號通路阻斷劑(AG490、FLLL32、BAY11-7082、SP600125、SB203580和Wortmannin)作用2h后,分別加入50%TTCS、50%NTCS或重組人GM-CSF,刺激12后,收集細胞用于流式染色,分析條件性中性粒細胞的表型。3.中性粒細胞在胃癌中的功能及作用機制流式分選胃癌組織及正常胃組織中的中性粒細胞,在加或不加anti-PD-L1抗體的條件下,按1:2的比例與CFSE標記的CD3+T細胞共培養(yǎng)5d后,收集細胞用于流式檢測,檢測CD3+T細胞的增殖及IFN-γ的產(chǎn)生。分選外周血中性粒細胞,用50%TTCS刺激中性粒細胞12h后獲得條件性中性粒細胞,在加或不加anti-PD-L1抗體的條件下,按1:2的比例分別與CFSE標記的同種或異種CD3+T細胞、PD-1+T細胞或PD-1-T細胞共培養(yǎng)5d后,收集細胞用于流式檢測,檢測CD3+T細胞的增殖及IFN-γ的產(chǎn)生。4.中性粒細胞的免疫抑制作用驗證及臨床意義研究給NOD/SCID小鼠皮下注射106個SGC-7901細胞,構建胃癌移植瘤模型。分選外周血中性粒細胞,用50%TTCS或1640培養(yǎng)基刺激12h后,在加或不加anti-PD-L1抗體或control Ig G抗體的條件下,與CD3+T細胞按1:1的比例共培養(yǎng)24h后,收集細胞,在移植瘤構建第10天時,通過腹腔注射途徑將細胞注射入小鼠體內。每兩天用游標卡尺測量移植瘤大小,直至第24d。殺死小鼠,取出移植瘤,測量大小并拍照,將移植瘤用多聚甲醛固定后,制成石蠟包埋組織切片用于免疫組化染色;取出小鼠脾臟,勻漿后收集細胞用于流式染色,檢測IFN-γ+CD3+T細胞應答情況。分析胃癌組織浸潤中性粒細胞與臨床指標的相關性;分析中性粒細胞及PD-L1+中性粒細胞與病人總體生存率的相關性。研究結果1.中性粒細胞在胃癌中的分布和表型特征;1.1胃癌患者外周血中性粒細胞百分率顯著高于健康成人。就胃癌患者本身,胃癌組織中性粒細胞百分率和絕對數(shù)(以每1,000,000個總細胞中中性粒細胞的絕對數(shù)量來統(tǒng)計)均顯著高于其他組織。免疫組織化學染色結果也表明,中性粒細胞在胃癌組織中浸潤增加。1.2與癌旁組織或非腫瘤正常胃組織相比,胃癌組織浸潤的中性粒細胞高表達中性粒細胞激活相關分子CD54及免疫抑制性分子PD-L1。胃癌組織中浸潤的CD54+中性粒細胞百分率與PD-L1+中性粒細胞百分率呈顯著正相關;胃癌組織中浸潤的CD54+中性粒細胞的絕對數(shù)與PD-L1+中性粒細胞絕對數(shù)呈顯著正相關。流式染色結果表明胃癌組織內浸潤的中性粒細胞共表達CD54和PD-L1分子,提示胃癌組織內浸潤的中性粒細胞的表型為激活/抑制雙重表型。2.胃癌微環(huán)境對中性粒細胞的調控及其調控機制2.1與NTCS及1640培養(yǎng)基(Medium)相比,TTCS可以顯著抑制中性粒細胞的凋亡,說明胃癌微環(huán)境可能通過延長中性粒細胞壽命而使中性粒細胞浸潤增加。2.2與NTCS及Medium相比,TTCS可以顯著上調中性粒細胞表面CD54及PD-L1的表達,說明胃癌微環(huán)境對于激活中性粒細胞并維持其免疫抑制表型起著重要作用。2.3腫瘤組織標本基因芯片分析結果顯示:TGF-β,M-CSF,G-CSF,IL-1β,IL-17A,IL-6,IL-23,IL-10,GM-CSF,IFN-γ,IL-22等細胞因子在腫瘤組織中高表達。用這些重組細胞因子刺激外周血中性粒細胞,發(fā)現(xiàn):GM-CSF可以顯著上調中性粒細胞表面CD54及PD-L1的表達。此外,阻斷TTCS中的GM-CSF可以顯著抑制中性粒細胞表面CD54及PD-L1的表達,而在NTCS中加入重組人GM-CSF后,可以顯著上調中性粒細胞表面CD54及PD-L1的表達。用ELISA試劑盒檢測胃癌組織、非腫瘤正常胃組織、TTCS及NTCS中的GM-CSF,結果發(fā)現(xiàn)胃癌組織中的GM-CSF表達顯著高于非腫瘤正常胃組織,TTCS中的GM-CSF濃度顯著高于NTCS。同時胃癌組織中的GM-CSF濃度與CD54+中性粒細胞及PD-L1+中性粒細胞浸潤數(shù)量呈正相關。免疫熒光雙染結果顯示GM-CSF來源于胃癌細胞。以上結果表明胃癌上皮細胞來源的GM-CSF在激活中性粒細胞并維持其免疫抑制表型中起著關鍵作用。2.4阻斷JAK或STAT3信號通路后,TTCS或GM-CSF均不能上調中性粒細胞表面CD54及PD-L1的表達;WB結果顯示:TTCS可以誘導中性粒細胞中STAT3信號通路的磷酸化,而阻斷TTCS中的GM-CSF后,STAT3的磷酸化受到抑制。說明GM-CSF上調中性粒細胞表面CD54及PD-L1的表達依賴于JAK-STAT3信號通路。3.中性粒細胞在胃癌中的功能及作用機制3.1與非腫瘤正常胃組織浸潤的中性粒細胞相比,胃癌組織浸潤的中性粒細胞可以顯著抑制CD3+T細胞的增殖及INFγ的產(chǎn)生,該抑制作用依賴于PD-L1通路。對胃癌標本的流式分析結果顯示胃癌微環(huán)境中浸潤的中性粒細胞百分率和T細胞百分率呈負相關,胃癌微環(huán)境中浸潤的中性粒細胞絕對數(shù)和T細胞絕對數(shù)也呈負相關。3.2條件性中性粒細胞可以顯著抑制同種或異種CD3+T細胞的增殖及INFγ的產(chǎn)生,該抑制作用依賴于PD-L1通路。3.3條件性中性粒細胞可以顯著抑制同種或異種PD-1+CD3+T細胞的增殖及INFγ的產(chǎn)生,該抑制作用依賴于PD-L1通路;而對PD-1-CD3+T細胞沒有抑制作用。說明條件性中性粒細胞對T細胞的抑制作用是依賴PD-1-PD-L1通路的。胃癌標本流式統(tǒng)計結果顯示胃癌微環(huán)境中的PD-L1+中性粒細胞與PD-1+T細胞在百分率和絕對數(shù)上呈負相關。4.中性粒細胞的免疫抑制作用驗證及臨床意義研究4.1與Medium組小鼠(注射PBS)相比,T cells+N組小鼠(注射經(jīng)正常中性粒細胞(N)處理的T細胞)的移植瘤體積明顯減小,說明正常的T細胞應答可以顯著抑制移植瘤生長;而與T cells+N組小鼠相比,T cells+TCN組小鼠(注射經(jīng)條件性中性粒細胞(TCN)處理的T細胞)的移植瘤體積明顯增加,說明TCN抑制了T細胞反應,從而解除了T細胞應答對腫瘤生長的抑制作用;與T cells+TCN組小鼠或T cells+TCN+control Ig G組(共培養(yǎng)體系中加入control Ig G抗體)相比,T cells+TCN+anti-PD-L1組小鼠(共培養(yǎng)體系中加入anti-PD-L1抗體)的移植瘤體積明顯縮小(P0.05),說明TCN對T細胞應答的抑制作用是通過免疫抑制性分子PD-L1起作用的。4.2檢測小鼠脾臟中IFN-γ+T細胞的應答情況,發(fā)現(xiàn):與T cells+TCN組或T cells+TCN+control Ig G處理組相比,T cells+TCN+anti-PD-L1組小鼠脾臟內IFN-γ+T細胞的比例顯著增加,說明TCN對T細胞應答的抑制作用是通過PD-L1實現(xiàn)的。4.3免疫組化染色結果顯示:與T cells+TCN組或T cells+TCN+control Ig G處理組相比,T cells+TCN+anti-PD-L1組小鼠移植瘤細胞的增殖明顯受到抑制,移植瘤內浸潤的CD3+T細胞明顯增加。說明TCN通過PD-L1抑制CD3+T細胞增殖,從而使移植瘤內CD3+T細胞浸潤減少,促進移植瘤進展。4.4臨床相關性分析顯示,增高的中性粒細胞百分率與淋巴管侵襲的累及、腫瘤大小的增長和腫瘤侵襲(T)分期的進展相關。根據(jù)胃癌組織浸潤中性粒細胞的百分率中位數(shù)(5.24%)將病人分為中性粒細胞高浸潤組(≥5.24%)和中性粒細胞低浸潤組(5.24%),統(tǒng)計病人44個月的總體生存率發(fā)現(xiàn),中性粒細胞高浸潤組病人的總體生存率顯著低于浸潤低組。用胃癌組織浸潤中性粒細胞絕對數(shù)對病人分組也得到同樣的結論。此外,根據(jù)胃癌組織浸潤PD-L1+中性粒細胞的百分率中位數(shù)(24%)將病人分為PD-L1+中性粒細胞高浸潤組(≥24%)和PD-L1+中性粒細胞低浸潤組(24%),統(tǒng)計病人20個月的總體生存率發(fā)現(xiàn),PD-L1+中性粒細胞高浸潤組病人的總體生存率顯著低于浸潤低組。用胃癌組織浸潤PD-L1+中性粒細胞絕對數(shù)對病人分組也得到同樣的結論。結論1.胃癌微環(huán)境中有大量中性粒細胞浸潤,其表現(xiàn)為激活/抑制雙重表型。2.胃癌微環(huán)境能夠延長中性粒細胞的壽命;胃癌細胞來源的GM-CSF通過JAK-STAT3信號通路激活中性粒細胞并上調其表面PD-L1的表達。3.胃癌激活的中性粒細胞通過PD-L1-PD-1通路抑制T細胞的功能,從而抑制胃癌免疫并促進胃癌進展。4.中性粒細胞百分比和數(shù)量與胃癌進展密切相關,并且可以預測病人的總體生存率。5.PD-L1+中性粒細胞的百分比和數(shù)量與胃癌進展密切相關,并且可以預測病人的總體生存率。意義本文在胃癌中發(fā)現(xiàn)了一群具有激活/抑制雙重表型的中性粒細胞。PD-L1+中性粒細胞可以作為新的檢測腫瘤微環(huán)境的指標,以其應答高低來判斷腫瘤微環(huán)境的狀態(tài),進而為腫瘤治療的術前調節(jié)、方案選擇和術后治療提供指導;在胃癌免疫治療中,既可以選擇免疫抑制性分子PD-L1為直接靶點,也可選擇以其“調控者”GM-CSF為間接靶點,為腫瘤免疫治療提供了新思路。
[Abstract]:Gastric cancer is one of the leading causes of cancer - related death in developing countries . The prognosis of gastric cancer patients is poor and the five - year survival rate is less than 30 % . The development and prognosis of gastric cancer are closely related to the immunosupression microenvironment of gastric cancer . The expression of neutrophils in human peripheral blood was detected by flow cytometry ( FCM ) and immunohistochemical staining . The expression of neutrophil in peripheral blood was detected by flow cytometry . After 12 hours of stimulating peripheral neutrophils in healthy adult peripheral blood , the cells were collected from peripheral blood neutrophils of healthy adults . The expression of CD54 and PD - L1 in gastric cancer tissues was significantly higher than that in healthy adults . The results showed that the total survival rate of patients with gastric cancer was significantly lower than that in patients with gastric cancer .

【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R735.2

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本文編號：1420656