發(fā)布時(shí)間：2018-01-13 22:23

  本文關(guān)鍵詞：慢性HBV感染患者甲基CpG結(jié)合結(jié)構(gòu)域家族的研究　出處：《山東大學(xué)》2017年博士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

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【摘要】：第一部分慢性乙型肝炎患者甲基CpG結(jié)合結(jié)構(gòu)域家族成員的研究研究背景乙肝病毒(hepatitis B virus,HBV)感染呈全球性流行。目前,全球慢性HBV感染患者大約有2.4億,其中每年因此病致死的人數(shù)多達(dá)65萬(wàn)。慢性HBV感染是由HBV復(fù)制與宿主免疫應(yīng)答協(xié)同作用而構(gòu)建的動(dòng)態(tài)過(guò)程。研究表明,表觀遺傳學(xué)調(diào)控尤其是DNA甲基化參與慢性HBV感染的過(guò)程,并在慢性HBV感染患者的結(jié)局中發(fā)揮重要作用。甲基CpG結(jié)合結(jié)構(gòu)域(methyl-CpG binding domain,MBD)家族蛋白作為表觀遺傳學(xué)中DNA甲基化的"讀出器",能夠識(shí)別基因組中CpG島上甲基化的胞嘧啶殘基,募集協(xié)同抑制因子,從而調(diào)控基因表達(dá)。此外,MBD蛋白的轉(zhuǎn)錄抑制作用也體現(xiàn)在染色質(zhì)重構(gòu)與組蛋白修飾的相互串?dāng)_中。MBD家族主要成員獨(dú)特的表觀遺傳學(xué)修飾功能,使得它們?cè)谀[瘤發(fā)生中可能的作用與機(jī)制也被學(xué)者所揭示。而最近的研究同時(shí)觀察到了 MBD家族主要成員在自身免疫性疾病,如系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus,SLE)與類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)等疾病中的變化。然而,慢性HBV感染過(guò)程中,MBD家族成員是否存在變化,能否在疾病進(jìn)展中發(fā)揮表觀遺傳學(xué)調(diào)控作用,卻仍未被闡明。目的本研究旨在測(cè)定慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)患者M(jìn)BD家族主要成員的變化,評(píng)估其在CHB病情進(jìn)展中可能的作用與聯(lián)系。研究方法本研究納入369例CHB患者與14例正常對(duì)照(healthy controls,HCs)人群。369例CHB患者是2014年6月-2016年8月于山東大學(xué)齊魯醫(yī)院肝病科收集的。研究組中223例CHB患者是2014年6月-2015年10月收集的,由20例免疫耐受(immune tolerant,IT)期、69例免疫清除(immune clearance,IC)期、103例低(非)復(fù)制期(non/low-replicative,LR)期與31 例再活動(dòng)(HBeAg negative hepatitis,ENH)期患者所構(gòu)成。驗(yàn)證組中146例CHB患者是2015年11月-2016年8月收集的,由16例IT期、44例IC期、67例LR期與19例ENH期患者所構(gòu)成。所有CHB患者中共有40例接受肝穿刺組織病理學(xué)檢查,其中研究組有34例,而驗(yàn)證組僅6例。谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase,AST)與血小板(platelet,PLT)比率指數(shù)(AST-to-PLT ratio index,APRI)積分被用于CHB患者肝臟纖維化程度的評(píng)估。CHB與HCs外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)中MBD家族主要成員mRNA的表達(dá)情況通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time polymerase chain reaction,RT-PCR)法測(cè)。結(jié)果1.CHB患者PBMCs中MeCP2、MBD1、MBD2以及MBD4mRNA水平均高于HCs。但是,CHB患者與HCs的MBD3 mRNA水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。2.CHB患者中MBD家族主要成員mRNA與病情嚴(yán)重程度的聯(lián)系:CHB患者M(jìn)BD2 mRNA水平與血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase,ALT)水平間呈正相關(guān)(r=0.151,P=0.028),MBD4 mRNA水平與血清ALT(r=0.18,P=0.008)、AST水平(r=0.208,P=0.003)間分別呈正相關(guān)。然而,MBD家族其他成員與肝功能指標(biāo)間并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)聯(lián)系。3.研究組中,HBeAg陽(yáng)性患者HBV DNA均為陽(yáng)性,且此類(lèi)患者的MBD2與MBD4mRNA相較陰性患者高表達(dá)。而HBeAg陰性患者則是由HBV DNA陽(yáng)性患者(組a)與陰性患者(組b)組成。我們觀察到組a患者PBMCs中MBD2、MBD3、MBD4 mRNA相較組b卻為低表達(dá)。4.CHB患者不同免疫分期間比較:CHB患者4個(gè)免疫分期PBMCs中MeCP2、MBD1與MBD2mRNA水平均高于HCs。其中,MBD1mRNA水平為IT期顯著高于其他3期;MBD2與MBD4 mRNA水平則為IC期顯著高于其他3期。MBD3 mRNA水平卻是僅IC期高于HCs。MBD4 mRNA水平是除ENH期外,IT、IC與LR期均高于HCs,同時(shí)LR期高于ENH期。但是,MeCP2與MBD3 mRNA水平在4個(gè)免疫分期間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。5.MBD1 mRNA對(duì)IT期的預(yù)測(cè)價(jià)值:雙變量logistic回歸表明研究組中MBD1 mRNA與IT期密切相關(guān)。受試者工作特征(receiver operating characteristics,ROC)曲線(xiàn)顯示,MBD1 mRNA預(yù)測(cè)IT期的曲線(xiàn)下面積(area under the curve of ROC,AUC)為0.732(P0.001),最佳截?cái)嘀禐?.0305,靈敏度75%,特異性65.52%。驗(yàn)證組中則發(fā)現(xiàn),MBD1 mRNA預(yù)測(cè)IT期的AUC為0.704(P=0.001),最佳截?cái)嘀凳?.0305,靈敏度與特異性分別是81.25%與61.54%。6.MBD2與MBD4 mRNA對(duì)IC期的預(yù)測(cè)價(jià)值:MBD2與MBD4 mRNA均與IC期密切相關(guān)。研究組中,二者預(yù)測(cè)IC期的AUC分別是0.671(P0.001)和0.716(P0.001),但AUC間統(tǒng)計(jì)無(wú)意義。MBD2mRNA的最佳截?cái)嘀禐?.0069,而MBD4 mRNA的最佳截?cái)嘀禐?.00099。它們的靈敏度、特異性分別是85.51%、44.81%與63.77%、75.97%。雙變量logistic回歸擬合MBD2與MBD4 mRNA聯(lián)合變量公式是:參數(shù)(MBD2聯(lián)合MBD4)=50.591×MBD2+555.483×MBD4-2.314。ROC曲線(xiàn)分析發(fā)現(xiàn),聯(lián)合變量預(yù)測(cè)IC期的AUC是0.736(P0.001),最佳截?cái)嘀凳?0.841,靈敏度68.12%,特異性69.48%。而且聯(lián)合變量對(duì)IC期的預(yù)測(cè)價(jià)值明顯優(yōu)于MBD2mRNA(P=0.0225)。驗(yàn)證組中,MBD2與MBD4mRNA預(yù)測(cè) IC期的AUC分別為0.665(P0.001)和0.741(P0.001)。對(duì)應(yīng)的最佳截?cái)嘀�、靈敏度、特異性分別是0.0069與0.00099、86.36%與70.45%、42.16%與71.57%。而聯(lián)合變量的AUC則是0.754,顯著高于MBD2 mRNA(P=0.004)其最佳截?cái)嘀凳?0.841,靈敏度與特異度是70.45%與70.59%。7.CHB患者不同肝臟纖維化與炎癥分期下MBD家族主要成員mRNA表達(dá)的變化:研究組中,S3+S4期患者M(jìn)eCP2mRNA水平均高于S0-S2期患者。此外,不同肝臟炎癥分級(jí)下MBD家族主要成員中僅MBD2 mRNA水平在G2期是顯著低于G1和G3+G4期。但其他MBD家族成員mRNA在不同肝臟纖維化分級(jí)與炎癥分期下表達(dá)并無(wú)不同。8.MeCP2 mRNA表達(dá)對(duì)CHB患者肝臟纖維化不同程度的預(yù)測(cè)意義:MeCP2 mRNA表達(dá)與肝臟纖維化程度間有著統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)。當(dāng)S≥2歸為重度纖維化時(shí),MeCP2 mRNA與APRI積分均可預(yù)測(cè)S≥2纖維化(AUC 0.761 VS 0.716,P=0.707)。而將S3+S4歸為重度纖維化時(shí),MeCP2 mRNA對(duì)其的預(yù)測(cè)價(jià)值優(yōu)于APRI積分(AUC 0.958 VS 0.717,P=0.0342),MeCP2 mRNA最佳截?cái)嘀凳?.0068,靈敏度100%,特異性85.19%。同時(shí),MeCP2 mRNA對(duì)S4期纖維化的預(yù)測(cè)價(jià)值也優(yōu)于APRI積分(AUC 0.946 VS 0.677,P=0.0424),其最佳截?cái)嘀凳?.0084,靈敏度與特異性則是100%與90.32%。這說(shuō)明,MeCP2 mRNA可以很好的預(yù)測(cè)反映S3+S4以及S4期纖維化。9.CHB患者M(jìn)BD家族成員mRNA的相關(guān)性分析:Spearman相關(guān)分析說(shuō)明,CHB 患者 PBMCs 中 MeCP2 與 MBD2(r=0.243,P0.001)、MBD1 與 MBD3(r=0.132,P=0.049)、MBD2與MBD3(r=0.209,P=0.002)的mRNA間都有正相關(guān)聯(lián)系。提示,CHB患者M(jìn)BD家族主要成員間存在密切聯(lián)系。結(jié)論1.CHB患者PBMCs中MBD家族主要成員mRNA表達(dá)異常。2.PBMCs中MBD1 mRNA的表達(dá)對(duì)CHB中IT期患者有著很好的預(yù)測(cè)價(jià)值。3.PBMCs中MBD2與MBD4mRNA對(duì)CHB中IC期患者有著很好的預(yù)測(cè)價(jià)值,而且MBD2與MBD4 mRNA的聯(lián)合變量對(duì)IC期的預(yù)測(cè)價(jià)值明顯優(yōu)于MBD2 mRNA。4.PBMCs中MeCP2 mRNA的表達(dá)可以反映CHB患者肝臟纖維化的程度。5.MBD家族主要成員參與CHB的發(fā)病過(guò)程并與疾病進(jìn)展間關(guān)系密切,提示其在評(píng)估CHB病情嚴(yán)重程度中的具有較好預(yù)測(cè)價(jià)值。第二部分慢加急性乙型肝炎肝衰竭患者甲基CpG結(jié)合結(jié)構(gòu)域家族成員的研究研究背景慢性乙肝病毒(hepatitis B virus,HBV)感染包括慢性HBV攜帶者、慢性乙型肝炎(chronichepatitisB,CHB)、隱匿性CHB、乙型肝炎肝硬化、慢加急性乙型肝炎肝衰竭(acute-on-chronic hepatitis B liver failure,ACHBLF)等等。所有慢性HBV感染中病情最為兇險(xiǎn)、短期死亡率最高的當(dāng)屬ACHBLF。該病在短期內(nèi)出現(xiàn)的肝功能惡化衰竭基于患者原有慢性肝病之上。而在我國(guó),約有八成慢加急性肝衰竭(acute-on-chronic liver failure,ACLF)患者存在基礎(chǔ)的慢性HBV感染,他們即為ACBHLF患者。ACHBLF病情進(jìn)展迅速、短期死亡率高達(dá)85%。時(shí)至今日,ACHBLF的治療依舊面臨巨大挑戰(zhàn)。嚴(yán)重肝臟疾病患者在病情發(fā)展過(guò)程中可能會(huì)進(jìn)入肝衰竭(liver failure,LF),即為L(zhǎng)F傾向患者。同時(shí),部分ACHBLF患者病情進(jìn)展迅速,但是在疾病初始階段表現(xiàn)并不明顯。密切監(jiān)測(cè)與早期干預(yù)這些可能會(huì)進(jìn)展為ACHBLF或者難治性ACHBLF的患者可能會(huì)降低其發(fā)病率與死亡率。所以,早期準(zhǔn)確預(yù)測(cè)ACHBLF極其重要而且尤為迫切。越來(lái)越多的學(xué)者觀察到,表觀遺傳學(xué)修飾介入到了 ACHBLF患者的發(fā)病之中。先前學(xué)者已陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了 MBD家族成員在腫瘤發(fā)生、自身免疫性疾病中的功能。我們之前也報(bào)道了MBD家族主要成員在CHB患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)中表達(dá)的改變,而且其改變提示MBD家族主要成員在評(píng)估CHB病情嚴(yán)重程度中具有較好的預(yù)測(cè)價(jià)值。ACHBLF與CHB之間存在顯著不同,它是從慢性感染向爆發(fā)性狀態(tài)轉(zhuǎn)變的。所以,研究MBD家族在ACHBLF中的作用依舊有重要意義。目的本研究旨在測(cè)定ACHBLF患者M(jìn)BD家族主要成員的變化,探討MBD家族主要成員在疾病進(jìn)展中的作用,評(píng)估其對(duì)ACHBLF患者病情預(yù)后中可能的預(yù)測(cè)價(jià)值。研究方法本研究納入于山東大學(xué)齊魯醫(yī)院肝病科收治的142例ACHBLF患者與80例CHB患者。ACHBLF患者被分為研究組與驗(yàn)證組,包含研究組92例,是2012年4月-2015年2月收治的患者;驗(yàn)證組50例,是2015年3月-2016年5月收治的患者。終末期肝病模型(model for end-stage liver disease,MELD)積分用于ACHBLF患者的病情評(píng)估。30例健康志愿者從山東大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院募集,歸為正常對(duì)照組(healthy controls,HCs)。所有研究對(duì)象PBMCs中MBD家族主要成員mRNA的表達(dá)情況通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time polymerase chain reaction,RT-PCR)法測(cè)定。結(jié)果1.ACHBLF患者血清白蛋白(albumin,ALB)和凝血酶原活動(dòng)度(prothrombin activity,PTA)低于CHB和HCs。相反,血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase,ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase,AST)、總膽紅素(total bilirubin,TBIL、國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化比值(international normalized ratio,INR)則高于CHB和HCs。在研究與驗(yàn)證組中,死亡組人群均具有較低的PTA和ALB,較高INR、TBIL和MELD積分以及肝性腦病(hepatic encephalopathy,HE)、腹水、自發(fā)性細(xì)菌性腹膜炎(spontaneous bacterial peritonitis,SBP)的發(fā)生率。2.MBD家族主要成員mRNA水平的變化:Kruskal-Wallis檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)ACHBLF患者M(jìn)BD1和MBD2 mRNA表達(dá)均較CHB和HCs上調(diào)。相反,ACHBLF患者M(jìn)BD4 mRNA表達(dá)卻明顯低于CHB患者,但高于HCs。此外,ACHBLF患者M(jìn)eCP2 mRNA表達(dá)亦高于HCs。與HCs相比,CHB患者M(jìn)eCP2、MBD1、MBD2和MBD4 mRNA表達(dá)均增多。此外,死亡組患者較存活組患者M(jìn)BD1和MBD2 mRNA水平明顯升高,而MBD4 mRNA水平則顯著減低。但兩組人群在MeCP2和MBD3的mRNA表達(dá)上并無(wú)不同。3.ACHBLF患者M(jìn)BD家族主要成員mRNA水平與臨床指標(biāo)的聯(lián)系:研究組中,MBD4mRNA水平與PTA間存在正相關(guān)聯(lián)系,而與TBIL、INR和MELD積分間則存在負(fù)相關(guān)聯(lián)系。但其他MBD家族成員mRNA水平與臨床指標(biāo)間并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)。Spearman相關(guān)分析MBD家族成員間的相關(guān)性,發(fā)現(xiàn)ACHBLF患者M(jìn)eCP2與MBD2(r=0.292,P=0.0055,MBD1與與MBD3(r=0.481,P0.00)mRNA間都有正相關(guān)聯(lián)系。4.MBD4 mRNA是ACHBLF患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素:Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型表明MELD積分、HE和MBD4 mRNA都是ACHBLF患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。5.研究組中,MBD4 mRNA表達(dá)對(duì)ACHBLF患者死亡率的預(yù)測(cè)價(jià)值:MBD4 mRNA預(yù)測(cè)ACHBLF患者1月死亡率的曲線(xiàn)下面積(area under the curve of receiver operating characteristics,AUC)為0.907,顯著高于MELD積分(0.714,P=0.0291)。說(shuō)明MBD4 mRNA是一個(gè)比MELD積分更好的預(yù)測(cè)1月死亡率的指標(biāo)。MBD4mRNA和MELD積分的最佳臨界值分別為0.0005365和21.87,靈敏度與特異性分別為83.33%、92.86%與72.22%、76.69%。研究組按照最佳截?cái)嘀捣纸M以比較組間的生存率。Log-rank分析發(fā)現(xiàn),MBD4mRNA≤0.0005365、MELD積分≥21.87的患者生存率較低,存活時(shí)間較短。MBD4 mRNA與MELD積分預(yù)測(cè)ACHBLF患者2月死亡率的AUC分別為0.816和0.811,最佳截?cái)嘀禐?.0005469和21.87,敏感度68.09%、93.33%,特異性68.09%、84.44%。Log-rank分析發(fā)現(xiàn)MBD4 mRNA≤0.0005469、MELD積分≥21.87的患者生存率較低,存活時(shí)間均較短。MBD4 mRNA與MELD積分預(yù)測(cè)ACHBLF患者3月死亡率的的AUC分別為0.762和0.847,最佳截?cái)嘀禐?.0005469和21.55,敏感度62.75%、92.68%,特異性72.55%、87.8%。MBD4mRNA≤0.0005469、MELD積分≥21.55的患者生存率較低,存活時(shí)間較短。然而,它們?cè)趯?duì)患者2月與3月死亡率的預(yù)測(cè)判斷上沒(méi)有差異存在。6.MBD4 mRNA表達(dá)對(duì)ACHBLF患者死亡率預(yù)測(cè)價(jià)值的驗(yàn)證:驗(yàn)證組PBMCs中MBD4 mRNA表達(dá)對(duì)ACHBLF患者1月死亡率的預(yù)測(cè)價(jià)值明顯優(yōu)于MELD積分(0.939 VS 0.762,P=0.035)。MBD4 mRNA≤0.0005365、MELD積分≥21.87的患者具有較低的生存率與較短的存活時(shí)間。在預(yù)測(cè)ACBHLF患者2月死亡率、3月死亡率上,兩指標(biāo)間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(0.843 VS 0.834,P=0.998)(0.787 VS 0.836,P=0.5037)。在對(duì)患者2月死亡率的預(yù)測(cè)中,MBD4mRNA≤0.0005469、MELD積分≥21.87的患者具有較低的生存率與較短的存活時(shí)間。而在3月死亡率的預(yù)測(cè)中,MBD4mRNA≤0.0005469、MELD積分≥21.55的患者具有較低的生存率以及較短的存活時(shí)間。結(jié)論1.ACHBLF患者PBMCs中MBD家族主要成員mRNA表達(dá)異常。2.PBMCs中MBD4mRNA表達(dá)可預(yù)測(cè)ACHBLF患者1、2、3月死亡率。重要的是,相較MELD積分,PBMCs中MBD4mRNA對(duì)ACHBLF患者1月死亡率的預(yù)測(cè)價(jià)值更高。3.ACHBLF患者PBMCs中MBD4 mRNA表達(dá)可作為一個(gè)非侵入性的預(yù)測(cè)疾病嚴(yán)重程度及早期預(yù)后的生物學(xué)標(biāo)志物。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：R512.62
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本文編號(hào)：1420817