發(fā)布時間：2016-11-13 14:38

  本文關(guān)鍵詞：CD73在慢性低灌注腦白質(zhì)損傷中的作用及其炎性調(diào)控機制研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《第三軍醫(yī)大學(xué)》 2015年

CD73在慢性低灌注腦白質(zhì)損傷中的作用及其炎性調(diào)控機制研究

后顯華  

【摘要】：研究背景和目的:血管性認知功能障礙是指由腦血管病危險因素和腦血管病引起的認知障礙,包括從輕度認知障礙到癡呆的一大類綜合征。缺血性腦白質(zhì)損傷是血管性認知功能障礙的主要原因之一,是動脈硬化性腦病的基本病理表現(xiàn),也是中老年血管性認知損害的主要病理類型。缺血性白質(zhì)損傷病變的病理特點是血腦屏障的破壞、膠質(zhì)細胞增生和脫髓鞘改變。其確切的分子病理機制尚不明確,目前認為主要與氧化應(yīng)激損傷、突觸結(jié)構(gòu)和功能異常和中樞膽堿能及單胺能系統(tǒng)神經(jīng)遞質(zhì)功能紊亂有關(guān)。最近的研究表明炎癥和免疫機制在慢性腦缺血白質(zhì)損傷中發(fā)揮重要的作用。腺苷是一種重要的胞外信號分子,通過激活四個G蛋白偶聯(lián)受體A1、A2A、A2B和A3腺苷受體參與調(diào)節(jié)機體生理和病理過程。在細胞氧化應(yīng)激和組織炎癥缺氧時,胞外腺苷濃度明顯增加。胞外腺苷作為一種重要的免疫抑制性分子通過結(jié)合效應(yīng)細胞的G-蛋白偶聯(lián)受體調(diào)節(jié)免疫和炎癥反應(yīng),是一個關(guān)鍵的內(nèi)源性免疫調(diào)節(jié)機制。胞外腺苷有兩個來源:第一,細胞內(nèi)生成腺苷轉(zhuǎn)運至胞外。第二,通過CD39和CD73的協(xié)同作用,將胞外腺嘌呤核苷(ATP、ADP)分解產(chǎn)生大量的腺苷,其中,CD73是限速酶。通過CD73基因敲除小鼠證實CD73是小鼠腦內(nèi)最主要的5’核苷酸酶,占所有AMP水解能力85-95%。上述結(jié)果表明CD73可能通過調(diào)節(jié)胞外腺苷水平在腦部疾病的免疫炎癥中發(fā)揮重要的作用。Braun等報道CD73在大鼠大腦中動脈閉塞模型腦梗死組織中表達明顯增加。Petrovic等發(fā)現(xiàn)CD73基因敲除小鼠在急性缺血性腦損傷模型中損傷和炎癥水平明顯高于野生型小鼠,說明CD73在急性缺血性腦損傷中是一種防御性調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)機制。我們前期的研究也表明腺苷A2A受體敲除加重慢性腦缺血腦白質(zhì)損傷,證實胞外腺苷通過作用于A2A受體會影響慢性低灌注性腦白質(zhì)損傷的病理過程。但是CD73作為胞外腺苷產(chǎn)生的限速酶,其在慢性低灌注性腦白質(zhì)損傷中的表達和功能尚不清楚。第一部分小鼠雙側(cè)頸總動脈套扎微型彈簧圈制作慢性低灌注性腦白質(zhì)損傷模型按照shibata等方法分離小鼠雙側(cè)頸總動脈,然后用內(nèi)徑0.18毫米的微型彈簧圈分別套扎左右兩側(cè)頸總動脈建立慢性低灌注性腦白質(zhì)損傷小鼠模型(bilateralcommoncarotidarterystenosissurgery,bcas)。假手術(shù)組(sham組)小鼠的處理方法為暴露雙側(cè)頸總動脈不圈套微型彈簧,其余處理同bcas模型組。在手術(shù)后第30天通過y型迷宮自發(fā)交替實驗和八臂迷宮實驗檢測模型小鼠認知功能改變,通過kluver-barrera染色評價胼胝體腦白質(zhì)脫髓鞘程度,通過抗gfap、iba-1免疫組織化學(xué)染色觀察模型小鼠在建模后30天膠質(zhì)細胞增生程度。第二部分cd73在慢性低灌注性腦白質(zhì)損傷的表達和活性改變在建模第30天通過westernblot檢測慢性低灌注性腦白質(zhì)損傷小鼠胼胝體cd73表達變化,cd73免疫組化染色檢測慢性低灌注性腦白質(zhì)損傷小鼠胼胝體cd73的表達分布。cd73和gfap/iba-1免疫雙標(biāo)熒光染色檢測胼胝體cd73表達細胞。5’-核苷酸酶檢測試劑盒檢測慢性低灌注性腦白質(zhì)損傷小鼠胼胝體cd73活性變化。第三部分cd73基因敲除對慢性低灌注性腦白質(zhì)損傷的影響將cd73基因敲除小鼠(bcas-ko)及其野生型小鼠(bcas-wt)分別通過微型彈簧圈套扎左右兩側(cè)頸總動脈制作慢性低灌注性腦白質(zhì)損傷小鼠模型。假手術(shù)組cd73基因敲除小鼠(sham-ko)及其野生型小鼠(sham-wt)小鼠的處理方法為暴露雙側(cè)頸總動脈不圈套微型彈簧,其余處理同bcas模型組。在手術(shù)后第30天通過y型迷宮自發(fā)交替實驗和八臂迷宮實驗檢測模型小鼠認知功能改變;通過kluver-barrera染色評價胼胝體腦白質(zhì)脫髓鞘程度,通過抗gfap、iba-1免疫組織化學(xué)染色觀察模型小鼠在建模后30天膠質(zhì)細胞增生程度。采用elisa檢測模型小鼠在建模第30天胼胝體的tnf-α、il-1β和il-6水平。結(jié)果:第一部分慢性低灌注性腦白質(zhì)損傷小鼠出現(xiàn)工作記憶損傷、白質(zhì)疏松和膠質(zhì)細胞激活八臂迷宮實驗表明bcas組小鼠工作記憶錯誤顯著高于sham組表明慢性低灌注能導(dǎo)致空間學(xué)習(xí)記憶障礙。另外y型迷宮小鼠自發(fā)交替實驗發(fā)現(xiàn)bcas組小鼠工作記憶錯誤顯著高于sham組,而兩組的自發(fā)運動能力沒有顯著差別。kluver-barrera染色可見bcas小鼠胼胝體神經(jīng)纖維稀疏、空泡形成、空隙增加,而sham組未見明顯改變提示慢性低灌注能導(dǎo)致白質(zhì)損傷。gfap、iba-1免疫組織化學(xué)染色顯示bcas組星型膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞增生明顯而sham組未見明顯改變。方法:第二部分慢性低灌注腦白質(zhì)損傷小鼠胼胝體CD73表達和活性增強Western blot結(jié)果表明BCAS組小鼠胼胝體CD73表達相比于Sham組明顯增加。CD73免疫組化結(jié)果提示慢性低灌注性腦白質(zhì)損傷小鼠胼胝體腦室旁白質(zhì)可見大量CD73免疫陽性細胞。我們采用CD73和GFAP/Iba-1免疫雙標(biāo)熒光染色發(fā)現(xiàn)慢性腦血流低灌注白質(zhì)損傷小鼠胼胝體CD73免疫陽性細胞主要是星形膠質(zhì)細胞。CD73活性測試表明BCAS組小鼠胼胝體5’-核苷酸酶活性相比于Sham組明顯增強。第三部分CD73基因敲除加重慢性低灌注性腦白質(zhì)損傷,促進膠質(zhì)細胞激活和釋放炎性因子八臂迷宮實驗表明BCAS-KO組小鼠工作記憶錯誤顯著高于BCAS-WT組,表明CD73基因敲除加重慢性低灌注導(dǎo)致的空間學(xué)習(xí)記憶損傷。另外Y型迷宮自發(fā)交替測試發(fā)現(xiàn)BCAS-KO組小鼠工作記憶錯誤顯著高于BCAS-WT組,而兩組的自發(fā)運動能力沒有顯著差別。Kluver-Barrera染色可見BCAS-KO小鼠胼胝體白質(zhì)疏松程度明顯高于BCAS-WT組提示CD73基因敲除加重慢性低灌注白質(zhì)損傷。GFAP、Iba-1免疫組織化學(xué)染色顯示BCAS-KO組星型膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞增生明顯高于BCAS-WT組提示CD73基因敲除能夠促進膠質(zhì)細胞活化和增殖。ELISA檢測顯示BCAS-KO組和BCAS-WT組小鼠胼胝體TNF-α、IL-1β和IL-6蛋白水平均增高,BCAS-KO組小鼠胼胝體TNF-α、IL-1β和IL-6等炎性因子蛋白水平增高比BCAS-WT組小鼠更加顯著。研究結(jié)論基于以上研究結(jié)果,我們得出以下研究結(jié)論:通過在小鼠雙側(cè)頸總動脈套扎內(nèi)徑為0.18毫米的彈簧圈,我們成功地構(gòu)建慢性低灌注性腦白質(zhì)損傷小鼠模型。主要表現(xiàn)為空間學(xué)習(xí)記憶障礙,腦白質(zhì)疏松和膠質(zhì)細胞的激活。慢性低灌注性腦白質(zhì)損傷小鼠胼胝體CD73表達和活性明顯增強。CD73基因敲除能夠進一步加重腦白質(zhì)損傷導(dǎo)致的空間學(xué)習(xí)記憶障礙,其機制主要與CD73基因敲除增強星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞的活化和增殖,釋放更多炎性因子包括TNF-α、IL-1β和IL-6有關(guān)。我們的研究表明CD73在慢性低灌注腦白質(zhì)損傷中表達和活性增高是一種代償性保護機制,可作為治療慢性缺血性腦損傷的治療靶點

【關(guān)鍵詞】：
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R743
【目錄】：

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