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  本文關(guān)鍵詞：定量檢測TAA自身抗體方法的建立及其在肝癌血清學(xué)診斷中的價值，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《鄭州大學(xué)》 2015年

定量檢測TAA自身抗體方法的建立及其在肝癌血清學(xué)診斷中的價值

任鵬飛  

【摘要】：目的和意義腫瘤相關(guān)抗原(tumor associated antigen, TAA)自身抗體是一類具有早期診斷肝癌潛力的腫瘤標(biāo)志物,發(fā)現(xiàn)具有理想診斷價值的TAA自身抗體指標(biāo)對肝癌診斷有重要意義。然而通過高通量篩選技術(shù)識別的候選TAA自身抗體數(shù)以千記,必須經(jīng)過人群血清的驗證才能從中鑒定出有較高診斷價值的指標(biāo)。而作為血清學(xué)驗證最為廣泛使用的ELISA方法,卻難以對新發(fā)現(xiàn)的自身抗體指標(biāo)進(jìn)行定量檢測,不同批次的檢測結(jié)果可比性差,限制了TAA自身抗體鑒定和評價工作的快速開展。因此,本研究的目的是在建立TAA自身抗體定量檢測技術(shù)的基礎(chǔ)上,從高通量篩選技術(shù)獲得的候選TAA.自身抗體中鑒定出具有較高診斷價值的指標(biāo),同時聯(lián)合現(xiàn)有的TAA自身抗體指標(biāo),篩選出對肝癌具有較高診斷價值的組合。為TAA自身抗體作為診斷肝癌的血清學(xué)方法向臨床應(yīng)用轉(zhuǎn)化奠定基礎(chǔ)。研究方法1.使用基因工程技術(shù)制備18種候選TAAs或TAAs。(1)對尚未獲得表達(dá)質(zhì)粒的目的蛋白構(gòu)建重組質(zhì)粒：將目的基因分別插入到表達(dá)載體pET-28a(+)質(zhì)粒中。(2)構(gòu)建目的蛋白的原核表達(dá)系統(tǒng)：分別將重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到表達(dá)宿主菌大腸桿菌BL21中,構(gòu)建原核表達(dá)系統(tǒng)。然后優(yōu)化IPTG誘導(dǎo)濃度,確定重組蛋白的可溶性。(3)目的蛋白的表達(dá)與純化：采用組氨酸標(biāo)簽蛋白純化方案純化13種組氨酸標(biāo)簽蛋白(包括NPM1、14-3-3 (?) MDM2、p53、Koc、IMP1、AHSG、FTL、 c-Myc、Survivin、Ra1A、HCC1.4、p62), GST標(biāo)簽蛋白純化方案純化5種GST標(biāo)簽蛋白(包括p16、Cyclin E、Cyclin B1、Cyclin D1、p90)。2.建立TAA.自身抗體標(biāo)準(zhǔn)化的定量ELISA檢測方法。(1)確定開發(fā)定量檢測方法的TAA自身抗體指標(biāo)：使用傳統(tǒng)ELISA方法初步鑒定10種候選TAA自身抗體,識別出可能有診斷價值的TAA自身抗體指標(biāo)。結(jié)合前期研究已確定的另外13種TAA自身抗體,確定擬開發(fā)定量檢測方法的TAA自身抗體種類。(2)建立每種TAA自身抗體的陽性標(biāo)準(zhǔn)品和陰性標(biāo)準(zhǔn)品：使用傳統(tǒng)ELISA方法和Western blot方法分別為每種自身抗體獲得一批強陽性血清、陰性血清。(3)采用棋盤滴定法優(yōu)化每種TAA自身抗體ELISA檢測時的關(guān)鍵反應(yīng)參數(shù)。(4)在參數(shù)優(yōu)化的工作基礎(chǔ)上,建立TAA自身抗體定量方法。1)根據(jù)IgG結(jié)構(gòu)的特點及Fc段與葡萄球菌白蛋白A特異結(jié)合的特性,提出IgG型自身抗體定量原理。2)測定定量標(biāo)準(zhǔn)品(人IgG)飽和包被濃度和定量標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍。3)分別嘗試使用Bardfrod法和直接ELISA法測定系列定量標(biāo)準(zhǔn)品在酶標(biāo)板上的實際吸附量。4)通過多次重復(fù)試驗,觀察定量標(biāo)準(zhǔn)曲線的穩(wěn)定性。3.評價多種TAA自身抗體在肝癌診斷中的價值。(1)使用本文建立的定量ELISA檢測方法檢測97例原發(fā)性肝細(xì)胞癌患者、83例肝硬化患者、89例慢性肝炎患者和104例正常人血清的TAA自身抗體濃度。(2)確定各種TAA自身抗體指標(biāo)的截斷值：分別使用均數(shù)加3倍標(biāo)準(zhǔn)差、ROC曲線和第95百分位數(shù)(P95)作為截斷值,觀察肝癌組、肝硬化組、慢性肝炎組和正常人的陽性率情況,選擇出合適的截斷值判斷方法。(3)以慢性肝炎和肝硬化患者為對照,評價聯(lián)合檢測多種TAA自身抗體對肝癌的診斷價值。1)使用并聯(lián)策略聯(lián)合多種TAA自身抗體指標(biāo),優(yōu)化出對肝癌診斷有較高價值的組合。2)以二分類非條件Logistic回歸模型作為聯(lián)合策略,將多個自身抗體指標(biāo)作為自變量,建立肝癌診斷的預(yù)測模型,ROC曲線評價預(yù)測模型對肝癌的診斷價值。(4)分析聯(lián)合檢測對AFP陰性肝癌患者的診斷價值。計算聯(lián)合檢測對AFP陰性肝癌患者的檢出率,聯(lián)合檢測結(jié)合AFP對肝癌患者檢出率提高的程度。結(jié)果1.成功構(gòu)建NPM1、14-3-3 (?) MDM2三種重組蛋白的原核表達(dá)系統(tǒng),建立起NPM1、14-3-3 (?) MDM2和p90四種重組蛋白的大量制備技術(shù),成功純化到18種候選TAAs或TAAs的重組蛋白。2.成功建立起IgG型TAA自身抗體標(biāo)準(zhǔn)化的定量檢測方法。(1)從10種候選TAAs自身抗體中初步鑒定出6種(NMP1、MDM2、14-3-3(?) p90、HCC1.4、FH)指標(biāo)可能對肝癌診斷有價值,而PBP、GLUD1、NDRG1和PRDX1可能對肝癌的診斷無價值。結(jié)合既往已確定的多種TAA自身抗體,選擇18種指標(biāo)開發(fā)定量ELISA檢測技術(shù)。(2)從18種指標(biāo)中獲得16種TAA自身抗體的陽性標(biāo)準(zhǔn)品和陰性標(biāo)準(zhǔn)品,優(yōu)化出每一種自身抗體ELISA檢測的關(guān)鍵反應(yīng)參數(shù)。(3)成功測出定量標(biāo)準(zhǔn)品IgG的線性包被濃度范圍為0～300ng/ml;并測定各個濃度定標(biāo)品的實際吸附質(zhì)量；確定了定量標(biāo)準(zhǔn)品吸附于酶標(biāo)板后穩(wěn)定存在,吸附量不被干擾條件影響。3.16種TAA自身抗體在肝癌診斷中的價值評價結(jié)果。(1)對于16種TAA自身抗體的截斷值判定,以慢性肝病組(包含慢性肝炎患者和肝硬化患者)的第95百分位數(shù)作為截斷值最為適宜。(2)兩種聯(lián)合策略中并聯(lián)檢測有更高的敏感性：并聯(lián)14種TAA自身抗體檢測肝癌的靈敏度可提高到82.5%,特異度為79.7%；而使用構(gòu)建Logistic回歸預(yù)測模型的聯(lián)合方式,共篩選出8種TAA自身抗體進(jìn)入回歸方程,采用ROC曲線法確定的最佳臨界點作為截斷值時,檢測的靈敏度可提高到70.8%,特異度為73.8%。(3)并聯(lián)檢測多種TAA自身抗體對AFP陰性肝癌患者具有重要意義：對于本研究中涉及的29例AFP陰性的肝癌患者,有26例(89.7%)并聯(lián)檢測結(jié)果陽性；對于87例既有AFP檢測又有TAA自身抗體檢測的肝癌患者,AFP結(jié)合并聯(lián)檢測的陽性檢出率為96.6%(84/87)。結(jié)論1.建立了一種IgG型TAA自身抗體通用的ELISA定量檢測方法,在方法學(xué)上為候選TAA抗體的鑒定和評價工作提供了一種較好的手段。2.聯(lián)合檢測多種TAA自身抗體能夠有效提高診斷肝癌的價值,通過不斷優(yōu)化組合有望成為一種有效診斷肝癌的血清學(xué)方法。

【關(guān)鍵詞】：
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R735.7
【目錄】：

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4 胥金章 黃顯斌;[N];健康報;2003年

5 胥金章 黃顯斌;[N];科技日報;2003年

6 胥金章、唐顯斌;[N];人民日報海外版;2003年

7 本報記者 魯海燕 通訊員 胥金章 黃顯斌;[N];華夏時報;2003年

8 ;[N];中國醫(yī)藥報;2004年

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前7條

1 任鵬飛;定量檢測TAA自身抗體方法的建立及其在肝癌血清學(xué)診斷中的價值[D];鄭州大學(xué);2015年

2 徐爽;早期宮頸癌患者外周血中腫瘤相關(guān)抗原自身抗體的研究[D];吉林大學(xué);2015年

3 金永龍;宮頸癌和乳腺癌患者血漿中腫瘤相關(guān)抗原自身抗體的研究[D];吉林大學(xué);2015年

4 張聚良;血管內(nèi)皮生長因子變異體基因的構(gòu)建、表達(dá)及表達(dá)產(chǎn)物體內(nèi)誘導(dǎo)自身抗體產(chǎn)生的研究[D];中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué);2003年

5 虞偉;基于自身抗體譜檢測型免疫芯片的制作研究與臨床初步應(yīng)用[D];東南大學(xué);2003年

6 付剛;改善心力衰竭預(yù)后的相關(guān)研究[D];吉林大學(xué);2014年

7 關(guān)松磊;肺癌和食管癌外周血免疫調(diào)節(jié)因子及腫瘤相關(guān)抗原的自身抗體研究[D];吉林大學(xué);2013年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 王英;新型自身抗體SP1對原發(fā)性干燥綜合征診斷的意義[D];福建中醫(yī)藥大學(xué);2015年

2 祁松楠;陣列技術(shù)應(yīng)用于非小細(xì)胞肺癌診療的研究[D];蘇州大學(xué);2015年

3 董超;三種眼外肌自身抗體在甲狀腺相關(guān)性眼病患者血清中的表達(dá)及意義[D];山西醫(yī)科大學(xué);2015年

4 彭玲;自身抗體譜檢測數(shù)據(jù)挖掘與報告解讀[D];四川醫(yī)科大學(xué);2015年

5 王廣杰;自身抗體的精密測定及其診斷價值[D];大連醫(yī)科大學(xué);2013年

6 冶麗娜;慢性丙型肝炎病毒感染者血清自身抗體的檢測及意義[D];新疆醫(yī)科大學(xué);2013年

7 馬士卉;重癥ITP中不同類型血小板自身抗體對丙種球蛋白療效的影響[D];山東大學(xué);2010年

8 孫煥霞;SLE患者及其子代與SLE相關(guān)基因及抗體的研究[D];青島大學(xué);2010年

9 左琳;心臟抗β_2—腎上腺素能受體自身抗體的臨床與實驗研究[D];山西醫(yī)科大學(xué);2004年

10 孔令濤;氧化脂蛋白（a）檢測及臨床應(yīng)用研究[D];南京理工大學(xué);2008年

  本文關(guān)鍵詞：定量檢測TAA自身抗體方法的建立及其在肝癌血清學(xué)診斷中的價值，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：181912