發(fā)布時(shí)間：2016-11-20 09:02

  本文關(guān)鍵詞：誘導(dǎo)胎盤來源間充質(zhì)干細(xì)胞向成牙骨質(zhì)細(xì)胞分化的實(shí)驗(yàn)研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《山東大學(xué)》 2015年

誘導(dǎo)胎盤來源間充質(zhì)干細(xì)胞向成牙骨質(zhì)細(xì)胞分化的實(shí)驗(yàn)研究

王磊  

【摘要】：牙周病涉及牙周膜、牙骨質(zhì)、牙槽骨三種不同組織,組織學(xué)表現(xiàn)為炎癥浸潤下的牙周膜退縮、牙槽骨吸收以及牙骨質(zhì)的暴露。牙周病牙周重建需要成骨細(xì)胞、成牙骨質(zhì)細(xì)胞以及牙周成纖維細(xì)胞的共同參與,但是因長期炎癥破壞,牙周病病病變區(qū)域的種子細(xì)胞數(shù)量有限,無法依靠自身種子細(xì)胞達(dá)到組織再生和功能重建,需要大量種子細(xì)胞移植至牙周病變區(qū)域,以滿足牙周組織重建的要求。而在牙周重建過程中,成牙骨質(zhì)細(xì)胞在牙周纖維的定植以及牙周膜的形成中起著重要作用,因此,選取可向成牙骨質(zhì)細(xì)胞定向分化的種子細(xì)胞,是牙周重建的關(guān)鍵。作為一類具有多向分化潛能的干細(xì)胞,間充質(zhì)干細(xì)胞在組織器官損傷修復(fù)以及再生治療方面,表現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景。目前,已經(jīng)在許多成人組織中成功分離出了不同組織來源的間充質(zhì)干細(xì)胞,并且成功應(yīng)用于重建受損組織和細(xì)胞基因治療。在多種間充質(zhì)干細(xì)胞中,胎盤來源間充質(zhì)干細(xì)胞來源更原始,多向分化能力更強(qiáng)；來源充足,無倫理問題；免疫原性低,可同種異體或異種移植；病毒感染率低,安全性高等方面的優(yōu)點(diǎn),具有更好的臨床應(yīng)用前景。而誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞定向分化,需要建立合適的誘導(dǎo)微環(huán)境。在牙周組織發(fā)育過程中,釉基質(zhì)蛋白衍生物起著不可或缺的作用。研究發(fā)現(xiàn)釉原蛋白是釉基質(zhì)蛋白最主要的活性成分,在牙周發(fā)育及改建過程中,具有促進(jìn)牙骨質(zhì)形成、牙周膜細(xì)胞增殖和骨誘導(dǎo)的能力,國內(nèi)外研究顯示其誘導(dǎo)干細(xì)胞向牙周表型分化效果可靠。因此,本實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建釉原蛋白腺病毒載體建立體外誘導(dǎo)微環(huán)境,誘導(dǎo)胎盤來源間充質(zhì)干細(xì)胞向成牙骨質(zhì)細(xì)胞分化,同時(shí)研究誘導(dǎo)非牙源性干細(xì)胞獲得的再生牙周細(xì)胞在正畸力作用下的反應(yīng)機(jī)制,為采用牙周組織工程進(jìn)行牙骨質(zhì)重建提供新的種子細(xì)胞來源,并為再生牙周在正畸力下反應(yīng)機(jī)制的研究提供參考依據(jù)。材料和方法1.釉原蛋白腺病毒過表達(dá)載體的構(gòu)建采用人X染色體的釉原蛋白cDNA編碼序列(GenBank Accession No.M86932)作為目的基因,在序列兩端分別加上EcpR Ⅰ和BamH Ⅰ酶切位點(diǎn),全基因合成法合成。利用限制性內(nèi)切酶EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ,將釉原蛋白基因插入到腺病毒輔助載體,然后將釉原蛋白腺病毒輔助載體和腺病毒骨架載體共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞,采用細(xì)胞內(nèi)同源重組方法,獲得復(fù)制缺陷型釉原蛋白腺病毒過表達(dá)載體。2.胎盤來源間充質(zhì)干細(xì)胞的分離及鑒定采用酶消化法消化人足月胎盤底蛻膜組織,通過密度梯度離心法獲取胎盤來源間充質(zhì)干細(xì)胞,倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長特點(diǎn)及形態(tài)變化；根據(jù)活細(xì)胞線粒體內(nèi)脫氫酶可還原CCK-8成有色的formazan的原理,采用CCK-8試劑盒檢測細(xì)胞增殖能力；利用不同細(xì)胞對光線的特征性散射原理,采用流式細(xì)胞儀檢測胎盤來源間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞周期及干細(xì)胞免疫表型(CD73、CD90、CD105、CD29、CD31、 CD34、 CD11b、CD19、CD45和HLA-DR);采用成骨誘導(dǎo)液及成脂誘導(dǎo)液誘導(dǎo)胎盤來源間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞及脂肪細(xì)胞分化,證實(shí)盤來源間充質(zhì)干細(xì)胞的多向分化能力。3.釉原蛋白腺病毒載體誘導(dǎo)胎盤來源間充質(zhì)干細(xì)胞向成牙骨質(zhì)細(xì)胞分化的體外實(shí)驗(yàn)將釉原蛋白腺病毒過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染胎盤來源間充質(zhì)干細(xì)胞,誘導(dǎo)其向成牙骨質(zhì)細(xì)胞分化。對轉(zhuǎn)染后的胎盤來源間充質(zhì)干細(xì)胞分別在細(xì)胞形態(tài)學(xué)、增殖活性、體外礦化能力及成牙骨質(zhì)細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)變化進(jìn)行誘導(dǎo)后的細(xì)胞表型鑒定。同時(shí),通過沉默F(xiàn)AK基因,研究非牙源性干細(xì)胞獲得的類成牙骨質(zhì)細(xì)胞在正畸力作用下破骨相關(guān)信號因子M-CSF、RANKL及OPG的反應(yīng)機(jī)制。結(jié)果1.采用細(xì)胞內(nèi)同源重組法獲得了高效過表達(dá)釉原蛋白的重組腺病毒Ad-AMG及對照腺病毒Ad-EGFP載體,Ad-EGFP證實(shí)腺病毒載體轉(zhuǎn)染效率高。以病毒載體通用引物進(jìn)行PCR鑒定,PCR產(chǎn)物測序證實(shí)腺病毒載體攜帶的釉原蛋白基因序列與Gen Bank人X染色體的釉原蛋白基因序列完全符合,同時(shí)提取了轉(zhuǎn)染Ad-AMG后293細(xì)胞的總蛋白,經(jīng)Western-Blot檢測證實(shí)了釉原蛋白的表達(dá)。2.本實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)的胎盤來源間充質(zhì)于細(xì)胞生長狀態(tài)良好,細(xì)胞呈現(xiàn)均一長梭形的成纖維細(xì)胞樣,細(xì)胞呈平行或漩渦狀排列生長。流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞免疫表型證實(shí)細(xì)胞表達(dá)典型的間充質(zhì)干細(xì)胞表面抗原標(biāo)記,不表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞及血細(xì)胞表面抗原標(biāo)記。多向分化潛能的鑒定,成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)3周以后,可見明顯高亮的礦化結(jié)晶,茜素紅染色表現(xiàn)為深紅色的結(jié)節(jié)。成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)培養(yǎng)2周以后,可見細(xì)胞胞漿內(nèi)串珠狀或篩孔狀圓形空泡充滿整個(gè)細(xì)胞,油紅0染色表現(xiàn)為橘紅色的圓泡。3.轉(zhuǎn)染釉原蛋白腺病毒過表達(dá)載體后,在釉原蛋白的誘導(dǎo)下,胎盤來源間充質(zhì)干細(xì)胞逐漸呈現(xiàn)典型的成牙骨質(zhì)細(xì)胞形態(tài),即由原來的長梭形向扁平狀、類圓形、多邊形或不規(guī)則形狀,細(xì)胞表面有短鈍突起；轉(zhuǎn)染后細(xì)胞增殖活性明顯降低,細(xì)胞蛋白合成功能增強(qiáng)；基因水平及蛋白水平檢測到了礦化因子BSP、OPN. OCN的表達(dá),對照組為陰性,證明在釉原蛋白的誘導(dǎo)下胎盤來源間充質(zhì)干細(xì)胞具有了礦化能力,同時(shí)RT-PCR及免疫組化檢測到了牙骨質(zhì)特異性蛋白CAP的表達(dá),證明胎盤來源間充質(zhì)干細(xì)胞分化為類成牙骨質(zhì)細(xì)胞。通過進(jìn)一步研究類成牙骨質(zhì)細(xì)胞在壓應(yīng)力作用下的反應(yīng)機(jī)制發(fā)現(xiàn),類成牙骨質(zhì)細(xì)胞RANKL及M-CSF的mRNA表達(dá)水平與壓應(yīng)力作用的時(shí)間成正比,隨著壓力加載時(shí)間的延長,RANKL/OPG的比值增大,結(jié)合M-CSF表達(dá)增高,說明在壓應(yīng)力作用下,類成牙骨質(zhì)細(xì)胞具備誘導(dǎo)破骨細(xì)胞形成及分化的功能。在沉默F(xiàn)AK基因后,類成牙骨質(zhì)細(xì)胞RANKL及M-CSF的mRNA表達(dá)水平隨壓應(yīng)力加載時(shí)間延長基本保持不變,但OPG的mRNA表達(dá)水平增高,RANKL/OPG的比值減小,通過干擾實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),FAK基因參與了類成牙骨質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化及成熟的過程。結(jié)論1.細(xì)胞內(nèi)同源重組法成功構(gòu)建了高效過表達(dá)釉原蛋白的重組腺病毒Ad-AMG及對照Ad-EGFP載體。Ad-AMG腺病毒載體轉(zhuǎn)染效率高且能夠正確地表達(dá)釉原蛋白。2.采用膠原酶Ⅱ消化組織并通過密度梯度分選法篩選出的胎盤來源間充質(zhì)干細(xì)胞純度較高,細(xì)胞為均一長梭形的成纖維細(xì)胞樣,呈平行或漩渦狀排列生長。流式細(xì)胞儀及誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)證實(shí)了其典型的間充質(zhì)干細(xì)胞特性。經(jīng)釉原蛋白誘導(dǎo)后,胎盤來源間充質(zhì)干細(xì)胞在細(xì)胞形態(tài)學(xué)、細(xì)胞增殖活性、體外礦化能力以及成牙骨質(zhì)細(xì)胞特征性相關(guān)基因表達(dá)上,均顯示了一些成牙骨質(zhì)細(xì)胞特性。證實(shí)胎盤來源間充質(zhì)干細(xì)胞在合適的誘導(dǎo)環(huán)境下可以向成牙骨質(zhì)細(xì)胞分化。3.誘導(dǎo)胎盤來源間充質(zhì)干細(xì)胞獲得的類成牙骨質(zhì)細(xì)胞在壓應(yīng)力作用下具備了誘導(dǎo)破骨細(xì)胞發(fā)生、成熟的功能,證明了非牙源性干細(xì)胞誘導(dǎo)向牙周細(xì)胞分化后可以參與正畸治療中牙周組織的改建。同時(shí),與細(xì)胞骨架重組有關(guān)的FAK基因參與了破骨相關(guān)信號因子的表達(dá)。

【關(guān)鍵詞】：
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R783.5
【目錄】：

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6 黎嬌;朱爭艷;杜智;駱瑩;王鵬;高英堂;;人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分泌物對肝細(xì)胞增殖和凋亡的影響[A];天津市生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)會第30次學(xué)術(shù)年會暨生物醫(yī)學(xué)工程前沿科學(xué)研討會論文集[C];2010年

7 譚遠(yuǎn)超;Kevin;姜紅江;黃相杰;周紀(jì)平;;間充質(zhì)干細(xì)胞在骨傷疾病治療中的應(yīng)用[A];首屆全國中西醫(yī)結(jié)合骨科微創(chuàng)學(xué)術(shù)交流會暨專業(yè)委員會成立大會論文匯編[C];2011年

8 唐佩弦;;間充質(zhì)干細(xì)胞及其臨床應(yīng)用前景[A];第三屆全國血液免疫學(xué)學(xué)術(shù)大會論文集[C];2003年

9 戴育成;;間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性和應(yīng)用[A];2005年華東六省一市血液病學(xué)學(xué)術(shù)會議暨浙江省血液病學(xué)學(xué)術(shù)年會論文匯編[C];2005年

10 胡琳莉;王昕榮;錢坤;李舟;楊薇;朱桂金;;小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞向子宮內(nèi)膜分化的實(shí)驗(yàn)研究[A];第一屆中華醫(yī)學(xué)會生殖醫(yī)學(xué)分會、中國動物學(xué)會生殖生物學(xué)分會聯(lián)合年會論文匯編[C];2007年

中國重要報(bào)紙全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 滿學(xué)杰;[N];新華每日電訊;2008年

2 滿學(xué)杰;[N];醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)報(bào);2008年

3 第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院輸血科 李忠俊 整理 吳劉佳;[N];健康報(bào);2013年

4 上海生科院 上海交大醫(yī)學(xué)院健康科學(xué)研究所 曹楷;[N];上�？萍紙�(bào);2014年

5 記者　陳建強(qiáng);[N];光明日報(bào);2006年

6 記者　馮國梧;[N];科技日報(bào);2007年

7 實(shí)習(xí)生 劉霞;[N];科技日報(bào);2007年

8 本報(bào)記者 王新佳;[N];中國高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)導(dǎo)報(bào);2005年

9 馮國梧;[N];科技日報(bào);2008年

10 劉瑩清;[N];北方經(jīng)濟(jì)時(shí)報(bào);2008年

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 鄭楚萍;功能化納米粒子對間充質(zhì)干細(xì)胞分化的影響及細(xì)胞成像的應(yīng)用[D];暨南大學(xué);2015年

2 王皓;五指山小型豬OCT-4、SOX-2基因在骨髓間充質(zhì)與臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞中的過表達(dá)研究[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2013年

3 孔德曉;間充質(zhì)干細(xì)胞及胰島素分泌細(xì)胞治療糖尿病的臨床及應(yīng)用基礎(chǔ)研究[D];山東大學(xué);2015年

4 董苑;SDF-1復(fù)合PDPBB的構(gòu)建及對間充質(zhì)干細(xì)胞趨化影響的研究[D];昆明醫(yī)科大學(xué);2015年

5 王磊;誘導(dǎo)胎盤來源間充質(zhì)干細(xì)胞向成牙骨質(zhì)細(xì)胞分化的實(shí)驗(yàn)研究[D];山東大學(xué);2015年

6 房賀;連接黏附分子A在促進(jìn)MSC修復(fù)CC14肝損傷中的作用及其機(jī)制[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2015年

7 陳潔;間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體對急性肺損傷小鼠的影響及相關(guān)機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究[D];中國人民解放軍醫(yī)學(xué)院;2015年

8 李雪;人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)機(jī)制的研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2015年

9 陳可;人臍帶來源間充質(zhì)干細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué);2010年

10 王靜;胎兒來源的間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性以及間充質(zhì)干細(xì)胞在肝纖維化中治療機(jī)制的研究[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué);2008年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 李超;小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中AC基因亞型的表達(dá)及AC3對其纖毛長度的影響[D];河北大學(xué);2015年

2 林濤;殼聚糖水凝膠復(fù)合脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)兔關(guān)節(jié)軟骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究[D];川北醫(yī)學(xué)院;2015年

3 彭龍英;心肌營養(yǎng)素1促進(jìn)人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞神經(jīng)分化存活及PI3K/Akt信號通路機(jī)制研究[D];遵義醫(yī)學(xué)院;2015年

4 喬曉慧;酸性環(huán)境對人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的影響[D];內(nèi)蒙古大學(xué);2015年

5 張紅霞;人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、鑒定及其對人肺癌細(xì)胞惡性表型的影響[D];內(nèi)蒙古大學(xué);2015年

6 顧立超;BTK抑制劑對間充質(zhì)干細(xì)胞miR-21的調(diào)節(jié)作用[D];河北聯(lián)合大學(xué);2014年

7 王文杰;鴨胚間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特性及其移植修復(fù)肝損傷研究[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2015年

8 張猛;血管內(nèi)皮前體細(xì)胞對間充質(zhì)干細(xì)胞分化潛能的影響[D];石河子大學(xué);2015年

9 馬麗媛;利用MyoD基因誘導(dǎo)綿羊臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分化為成肌細(xì)胞的研究[D];東北林業(yè)大學(xué);2015年

10 宋維文;MicroRNA-133誘導(dǎo)綿羊間充質(zhì)干細(xì)胞分化為成肌細(xì)胞的研究[D];東北林業(yè)大學(xué);2015年

  本文關(guān)鍵詞：誘導(dǎo)胎盤來源間充質(zhì)干細(xì)胞向成牙骨質(zhì)細(xì)胞分化的實(shí)驗(yàn)研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號：183242