本文關(guān)鍵詞：三氯乙烯致肝細(xì)胞毒性中SET介導(dǎo)的nucleolin自調(diào)控機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：背景與目的三氯乙烯(trichloroethylene, TCE)曾是一種被廣泛使用的工業(yè)溶劑,被用作金屬清洗、火箭引擎清潔、干洗以及植物油萃取、甚至麻醉劑的主要成分等。同時(shí)三氯乙烯也被作為原料來制造各種塑料制品,包括輸送管線、電線、電纜涂層及包裝材料等。三氯乙烯已成為廣東省和深圳市的重點(diǎn)職業(yè)毒物,曾給廣東省和深圳市帶來嚴(yán)重的職業(yè)危害和重大的經(jīng)濟(jì)損失。三氯乙烯同時(shí)也是一種環(huán)境化學(xué)污染物,它主要通過呼吸道吸入和皮膚吸收進(jìn)入機(jī)體產(chǎn)生危害。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證明三氯乙烯及其代謝產(chǎn)物可引起遺傳毒性、致癌、致突變等作用。2011年,美國環(huán)保署(EPA)將三氯乙烯正式定性為人類致癌物。不到一年時(shí)間,國際癌癥研究中心(IARC)同樣也將三氯乙烯從Ⅱ類可能致癌物提升為Ⅰ類人類致癌物。盡管隨著用途的變化及替代化合物的廣泛使用,人們對(duì)三氯乙烯在工業(yè)生產(chǎn)中職業(yè)暴露的機(jī)會(huì)越來越少,然而其對(duì)地下水源的污染卻正在成為一個(gè)非常重要的環(huán)境問題,因此在日常生活中,三氯乙烯暴露的風(fēng)險(xiǎn)其實(shí)并未減少。肝臟是三氯乙烯在體內(nèi)的重要代謝場(chǎng)所和和主要受損器官之一,三氯乙烯在肝臟中主要代謝途徑為：細(xì)胞色素P450 (cytochrome P450, CYP450)將三氯乙烯氧化為三氯乙烯環(huán)氧化物(trichloroethylene epoxide)中間體,以及毒性較低的三氯乙醛(chlorinated aldehyde)、三氯乙醇(trichloroethanol)和三氯乙酸(trichloroacetic acid),然后這些代謝物經(jīng)由尿液排出體外。另一條途徑是三氯乙烯在谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferase, GST)的作用下與谷胱甘肽(glutathione, GSH)結(jié)合,形成S-(1,2-二氯乙烯)谷胱甘肽(DCVG),然后被進(jìn)一步代謝為S-(1,2-二氯乙烯)-L-半胱氨酸(DCVC)后在肝臟中被逐步分解。三氯乙烯肝臟損害的分子機(jī)制仍不太清楚,也缺乏全面系統(tǒng)的研究。在前期工作中,課題組已利用人正常肝細(xì)胞(HL-7702,簡稱L-02)研究三氯乙烯的肝細(xì)胞毒性機(jī)制,利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)篩選了三氯乙烯誘導(dǎo)L-02細(xì)胞中的差異蛋白,發(fā)現(xiàn)SET蛋白在L-02細(xì)胞中與三氯乙烯染毒劑量呈劑量-效應(yīng)關(guān)系。通過構(gòu)建SET-siRNA穩(wěn)定干擾的L-02細(xì)胞發(fā)現(xiàn),SET蛋白介導(dǎo)了三氯乙烯誘導(dǎo)的L-02細(xì)胞毒性。SET蛋白是生命進(jìn)程中的一個(gè)重要因子,它參與了眾多關(guān)鍵的生物過程,包括細(xì)胞凋亡、核小體組裝、染色質(zhì)重構(gòu)等,同時(shí)它還是真核細(xì)胞中重要的組蛋白分子伴侶,它不僅僅參與染色質(zhì)重構(gòu),還是組蛋白乙�；�轉(zhuǎn)移酶抑制因子的重要組成部分,并參與組蛋白乙�；�修飾的抑制過程。SET蛋白也是一個(gè)與腫瘤密切相關(guān)的蛋白,有多種研究表明SET蛋白參與腫瘤細(xì)胞的增殖及腫瘤形成。SET蛋白也是細(xì)胞中重要的內(nèi)源性去磷酸化修飾酶——磷酸酯酶2A(Phosphotase 2A,PP2A)特異性的抑制因子,盡管SET蛋白特異性地抑制PP2A的活性,它卻可以在二價(jià)錳離子存在的條件下激活磷酸酯酶1。由此可見,SET蛋白在細(xì)胞中最重要的生物學(xué)過程,磷酸化修飾中扮演著關(guān)鍵角色,并且起到相當(dāng)重要的作用。蛋白質(zhì)的磷酸化修飾在真核細(xì)胞的生命進(jìn)程中分子調(diào)控與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中起到了最基本也是最重要的作用。蛋白質(zhì)的磷酸化修飾是通過蛋白激酶將三磷酸腺苷(ATP)上的磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到目標(biāo)蛋白的特定氨基酸殘基上。蛋白質(zhì)的某種活性就能夠通過這樣的反應(yīng)將一個(gè)或多個(gè)特點(diǎn)位點(diǎn)的磷酸化修飾被激活或抑制,從而介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄、代謝、細(xì)胞周期、分化、凋亡、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞免疫等過程。盡管SET蛋白在蛋白磷酸化修飾中具有重要地位,它參與磷酸化修飾的分子機(jī)制及生物學(xué)意義仍然未被完全闡明。本研究在前期基礎(chǔ)上進(jìn)一步探討SET蛋白介導(dǎo)的三氯乙烯致肝細(xì)胞毒性中蛋白磷酸化變化及其生物學(xué)意義。利用磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)篩選在L-02細(xì)胞中與三氯乙烯毒性相關(guān)以及SET介導(dǎo)的磷酸化蛋白,然后進(jìn)一步探討了SET蛋白參與nucleolin的整體磷酸化修飾及其自調(diào)控機(jī)制。實(shí)驗(yàn)方法一、三氯乙烯誘導(dǎo)的L-02肝細(xì)胞毒性中磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)研究1.細(xì)胞培養(yǎng)與染毒處理L-02細(xì)胞與SET-siRNA穩(wěn)定干擾的L-02細(xì)胞在37℃,5%CO2條件下,分別用含12%FBS,1%雙抗的RPMI 1640培養(yǎng)基貼壁培養(yǎng)于75 cm2細(xì)胞瓶中,待細(xì)胞融合度達(dá)到70%以上時(shí),分別對(duì)L-02細(xì)胞與SET-siRNA穩(wěn)定干擾的L-02細(xì)胞進(jìn)行三氯乙烯染毒處理24h,染毒濃度為1/2IC50值(16 mmol/L),即8 mmol/L。2.蛋白提取及蛋白酶解染毒處理后消化細(xì)胞,用PBS洗滌三次,用PhosphoSafe磷酸化蛋白裂解液重懸并裂解細(xì)胞,高速離心后取含蛋白粗提物的上清液。用Thermo BCA Quantification kit對(duì)樣品總蛋白進(jìn)行定量后每個(gè)樣品取出100μg,利用TEAB緩沖液及超濾離心管進(jìn)行溶液置換,二硫鍵還原及烷基化反應(yīng),然后每個(gè)樣品分別加入1μg胰蛋白酶,37℃進(jìn)行過夜酶解。3. iTRAQ標(biāo)記、磷酸化多肽富集以及樣品脫鹽處理酶解產(chǎn)物經(jīng)凍干及重溶,利用iTRAQ標(biāo)記物(113,114,115,116,121)分別針對(duì)不同實(shí)驗(yàn)重復(fù)及不同組的樣品進(jìn)行標(biāo)記(121標(biāo)記所有組混合而成的內(nèi)標(biāo)),然后用超純水終止標(biāo)記。標(biāo)記產(chǎn)物進(jìn)行混合后再經(jīng)冷凍干燥,利用基于二氧化鈦(Ti02)的IMAC技術(shù)對(duì)磷酸化多肽進(jìn)行富集,并洗脫非磷酸化多肽。所得富集產(chǎn)物再利用C18填充的固相萃取柱進(jìn)行脫鹽處理。4.液相分離及質(zhì)譜檢測(cè)利用水相為流動(dòng)相,用C18富集柱對(duì)多肽樣品進(jìn)行富集,然后用5-55%梯度的乙腈在C18分析柱中洗脫樣品90min。多肽經(jīng)Nanospray Ⅲ source被電離及霧化后進(jìn)入質(zhì)譜進(jìn)行檢測(cè),收集母離子及子離子信號(hào),經(jīng)過ProteinPilot Softwarev.4.5軟件進(jìn)行離子峰提取,然后利用Mascot引擎進(jìn)行蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫檢索,并生成隨機(jī)序列的誘餌庫將假陽性率控制在1%之內(nèi)。5.相對(duì)定量及生物信息學(xué)分析從所有鑒定的磷酸化多肽中篩選出在三次實(shí)驗(yàn)重復(fù)中都出現(xiàn)的多肽,然后將報(bào)告離子信號(hào)與內(nèi)標(biāo)均一化。以同一蛋白的不同磷酸化多肽的母離子信號(hào)峰面積為權(quán)重,再取均一化后帶權(quán)重的iTRAQ報(bào)告離子強(qiáng)度平均值,每條磷酸化多肽報(bào)告離子強(qiáng)度除以其平均值得到相對(duì)磷酸化多肽強(qiáng)度,以此數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)再進(jìn)行min/max轉(zhuǎn)換(-1到1之間),然后進(jìn)行單因素方差分析。對(duì)差異的磷酸化蛋白利用R語言clusterProfiler包分別對(duì)其進(jìn)行KEGG通路富集以及GO功能富集。6.差異磷酸化修飾的Western-blot驗(yàn)證收集染毒處理的正常L-02細(xì)胞及SET-siRNA穩(wěn)定干擾的L-02細(xì)胞,提取總蛋白并進(jìn)行蛋白定量。根據(jù)蛋白定量結(jié)果,等量上樣進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳。電泳完成后,將樣品轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,再分別孵育nucleolin、4E-BP1 (phospho T46)、MCM2、MCM2 (phospho S139)以及GAPDH抗體,然后加相應(yīng)二抗進(jìn)行孵育,最后將PVDF膜進(jìn)行曝光、圖像處理及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。二、三氯乙烯致肝細(xì)胞毒性中SET介導(dǎo)的nucleolin自調(diào)控機(jī)制研究1. Western-blot驗(yàn)證nucleolin整體磷酸化及其表達(dá)水平變化收集染毒處理的正常L-02細(xì)胞及SET-siRNA穩(wěn)定干擾的L-02細(xì)胞,提取總蛋白并進(jìn)行蛋白定量。根據(jù)蛋白定量結(jié)果,等量上樣進(jìn)行Phos-tag-SDS-PAGE凝膠電泳。電泳完成后將樣品轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,再分別孵育nucleolin以及GAPDH抗體,然后加相應(yīng)二抗進(jìn)行孵育,最后將PVDF膜進(jìn)行曝光、圖像處理及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。2. C-myc被抑制后nucleolin在L-02細(xì)胞中的表達(dá)變化L-02細(xì)胞在37℃,5%CO2條件下分別貼壁培養(yǎng)于六孔板中,待融合度達(dá)到75%以上,加入不同濃度(0μM、20 μM、40 μM、80 μM、100 μM)的c-myc抑制劑處理24h,然后用Western-blot分別檢測(cè)c-myc與nucleolin蛋白表達(dá)水平的變化。3.在三氯乙烯作用下SET介導(dǎo)的c-myc與nucleolin相互作用的變化收集染毒處理的正常L-02細(xì)胞及SET-siRNA穩(wěn)定干擾的L-02細(xì)胞,提取總蛋白并進(jìn)行蛋白定量。按照Co-IP試劑盒說明,將nucleolin與c-myc抗體分別與A/G Plus瓊脂柱進(jìn)行結(jié)合,使抗體交聯(lián)在瓊脂柱上,每組等量上樣后,分別以nucleolin與c-myc為誘餌蛋白進(jìn)行免疫共沉淀實(shí)驗(yàn),被沉淀的蛋白用Western-blot分別檢測(cè)c-myc與nucleolin水平變化。三、三氯乙烯誘導(dǎo)的L-02肝細(xì)胞毒性中SET介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究1.細(xì)胞處理、熒光標(biāo)記及芯片雜交L-02細(xì)胞與SET-siRNA穩(wěn)定干擾的L-02細(xì)胞分別用8 mM三氯乙烯處理24小時(shí),收集細(xì)胞,提取總RNA,按照Eukaryotic Poly-A RNA Control Kit、Eukaryotic Hybridization Control Kit、Hybridization, Wash, and Stain Kit試劑盒說明配制所需熒光標(biāo)記及清洗試劑,然后進(jìn)行熒光標(biāo)記、雜交及掃描。2.質(zhì)量控制、相對(duì)定量及通路變異分析利用R語言包Affy進(jìn)行質(zhì)量控制。不同探針針對(duì)同一個(gè)基因取信號(hào)強(qiáng)度的中位數(shù),同一個(gè)基因不同轉(zhuǎn)錄本取信號(hào)強(qiáng)度的總和,然后利用線性模型及貝葉斯統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)對(duì)基因轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行相對(duì)定量分析。為了進(jìn)一步探索SET可能介導(dǎo)的通路變化,利用基因集變異分析(GSVA)算法篩選被激活／抑制的通路。實(shí)驗(yàn)結(jié)果一、三氯乙烯誘導(dǎo)的L-02肝細(xì)胞毒性中SET介導(dǎo)的磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)研究1.共鑒定了107個(gè)磷酸化蛋白以及1878個(gè)磷酸化位點(diǎn),其中1647個(gè)磷酸化位點(diǎn)未被收錄在Phospho.ELM及PhosphoSitePlus兩個(gè)主要磷酸化位點(diǎn)數(shù)據(jù)庫中,可能是未見報(bào)道的新磷酸化位點(diǎn)。2.在鑒定的磷酸化蛋白中,有37個(gè)蛋白的44個(gè)磷酸化修飾位點(diǎn)在三組細(xì)胞的對(duì)比分析中(第一組：L-02細(xì)胞經(jīng)三氯乙烯處理；第二組；正常L-02細(xì)胞與SET-siRNA穩(wěn)定干擾的L-02細(xì)胞；第三組：SET-siRNA穩(wěn)定干擾的L-02細(xì)胞經(jīng)三氯乙烯處理)均發(fā)生了不同程度的改變,并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。3.13個(gè)蛋白的14個(gè)磷酸化位點(diǎn)在第一組與第三組細(xì)胞中變化趨勢(shì)相反,結(jié)果顯示,它們是三氯乙烯致肝細(xì)胞毒性中SET介導(dǎo)的差異磷酸化蛋白。4.差異磷酸化蛋白的功能性富集顯示其涉及5條相關(guān)通路、33種不同的分子功能、159個(gè)不同的生物學(xué)進(jìn)程以及51種不同的細(xì)胞組分,分析發(fā)現(xiàn)這些磷酸化蛋白大部分為核蛋白且與轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能相關(guān)。5.在差異磷酸化蛋白中,利用Western-blot驗(yàn)證了4E-BP1(T46) (2.52±0.23、 2.65±0.44、1.35±0.21, P=1.268e-10)和MCM2 (S139) (0.34±0.07、0.75 ±0.08、4.50±1.07, P=5.714e-11)磷酸化修飾的變化。其中4E-BP1(T46)在三氯乙烯處理的L-02細(xì)胞與SET-siRNA穩(wěn)定干擾的L-02細(xì)胞中磷酸化水平均呈上升趨勢(shì),但變化的幅度不同；MCM2(S139)在三氯乙烯處理的L-02細(xì)胞與SET-siRNA穩(wěn)定干擾的L-02細(xì)胞中的磷酸化水平均顯著性降低,但下降的幅度不一樣。二、三氯乙烯致肝細(xì)胞毒性中SET介導(dǎo)的nucleolin自調(diào)控機(jī)制研究1.結(jié)果顯示,Nucleolin在正常L-02細(xì)胞中經(jīng)三氯乙烯處理后其整體磷酸化程度降低,而在SET-siRNA穩(wěn)定干擾的L-02細(xì)胞中經(jīng)三氯乙烯處理后其整體磷酸化程度升高。但檢測(cè)nucleolin蛋白表達(dá)水平時(shí),發(fā)現(xiàn)SET介導(dǎo)的其表達(dá)水平趨勢(shì)與整體磷酸化改變趨勢(shì)相反。2. Nucleolin的轉(zhuǎn)錄因子c-myc被抑制的結(jié)果顯示,c-myc表達(dá)水平下降,同時(shí)nucleolin表達(dá)水平也隨之下降。3. Co-IP及Western-blot檢測(cè)結(jié)果顯示,c-myc與nucleolin之間存在相互作用,且它們的結(jié)合在正常L-02細(xì)胞經(jīng)三氯乙烯處理后減少,而在SET-siRNA穩(wěn)定干擾的L-02細(xì)胞經(jīng)三氯乙烯處理后增加,其變化趨勢(shì)與表達(dá)水nucleolin平變化相反,而與其整體磷酸化修飾變化趨勢(shì)相同。三、三氯乙烯誘導(dǎo)的L-02肝細(xì)胞毒性中SET介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究1.質(zhì)控結(jié)果顯示,經(jīng)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后芯片之間總體信號(hào)強(qiáng)度沒有偏離,且RNA降解測(cè)試顯示,樣品中沒有明顯的RNA降解存在。2.4個(gè)基因在正常L-02細(xì)胞及穩(wěn)定干擾的L-02細(xì)胞經(jīng)三氯乙烯染SET-siRNA毒處理后均被檢測(cè)到差異表達(dá),其中有1個(gè)基因表達(dá)變化在兩種細(xì)胞中呈相反方向；39個(gè)基因在第一組與第二組細(xì)胞間變化均不明顯(P0.01)而在第三組細(xì)胞間表達(dá)顯著變化(P0.01),因此,這些變化可能是SET介導(dǎo)的基因表達(dá)變化。3.經(jīng)分析,SET介導(dǎo)的差異表達(dá)基因與STRING及c-myc蛋白相互作nucleolin用發(fā)現(xiàn),酪氨酸-3單氧化酶／色氨酸-5單氧化酶激活蛋白高親和受體蛋白Fc片段114-3-3 tau (YWHAQ)、IgE以及睫狀神經(jīng)生長(FCER1G)因子受體均為細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白,同時(shí)(CNTFR)與YWHAQ都CNTFR與和c-myc相關(guān)。nucleolin基因集變異分析發(fā)現(xiàn),在第一組細(xì)胞中,13條通路被抑制,7條通路被激活；在第二組細(xì)胞中,5條通路被抑制,3條通路被激活；在第三組細(xì)胞中,1條通路被激活。結(jié)論1.鑒定了107個(gè)磷酸化蛋白以及1878個(gè)磷酸化位點(diǎn),其中38個(gè)磷酸化蛋白的51個(gè)位點(diǎn)的磷酸化修飾在不同組中均發(fā)生了不同程度的改變,其中SET介導(dǎo)了13個(gè)蛋白的14個(gè)磷酸化位點(diǎn)改變。并驗(yàn)證了三氯乙烯誘導(dǎo)的4E-BP1(T46)和MCM2(S139)磷酸化修飾的變化。2. SET在三氯乙烯誘導(dǎo)的L-02細(xì)胞毒性中介導(dǎo)了nucleolin的整體磷酸化修飾,并以此影響nucleolin與c-myc蛋白的相互結(jié)合,從而導(dǎo)致nucleolin蛋白表達(dá)的自調(diào)控過程。3. 在三氯乙烯誘導(dǎo)的L-02細(xì)胞毒性中,nucleolin與c-myc的相互作用可能參與調(diào)控SET介導(dǎo)的YWHAQ、FCERIG及CNTFR等凋亡相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。同時(shí),SET蛋白還可能參與激活三氯乙烯L-02細(xì)胞毒性中Thrombin-Par4信號(hào)通路。

  本文關(guān)鍵詞：三氯乙烯致肝細(xì)胞毒性中SET介導(dǎo)的nucleolin自調(diào)控機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。