發(fā)布時間：2016-12-01 19:25

  本文關(guān)鍵詞：酸性微環(huán)境對單核-巨噬細胞、Tca8113細胞的影響及雷公藤甲素在其中的作用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《貴陽醫(yī)學院》 2015年

酸性微環(huán)境對單核-巨噬細胞、Tca8113細胞的影響及雷公藤甲素在其中的作用

馮紅超  

【摘要】：目的:腫瘤細胞在利用周圍環(huán)境增殖的同時,也在改變其生長的微環(huán)境,使細胞外呈現(xiàn)酸性,間質(zhì)細胞中單核-巨噬細胞受微環(huán)境的變化而影響其表型分化及功能狀態(tài),更多的參與了腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。本研究模擬腫瘤細胞外酸性微環(huán)境,了解酸性微環(huán)境下Tca8113細胞增殖及分泌細胞因子等生物學行為的變化、酸性微環(huán)境對巨噬細胞表型分化及功能狀態(tài)的影響及雷公藤甲素(TP)在此過程中的干預效果,進一步了解腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及腫瘤細胞抵御治療的機制,也為抗腫瘤藥物的研發(fā)提供新的思路和理論基礎(chǔ)。方法:1、通過10%HCl調(diào)整細胞培養(yǎng)液的p H值分別為7.2、7.0、6.8、6.6下進行64h Tca8113細胞的培養(yǎng),ELISA法測定培養(yǎng)液中的白細胞介素-8(interleukin-8,IL-8)、單核細胞趨化蛋白-1(monocyte chemotactic protein 1,MCP-1)和低氧誘導因子-1(hypoxia inducible factor-1,HIF-1)的含量,MTS法測定Tca8113細胞增殖情況;2、流式細胞儀分離人外周血單核細胞,通過10%HCl調(diào)整細胞培養(yǎng)液的p H值分別為7.2、7.0、6.8、6.6,分別單獨培養(yǎng)及與Tca8113細胞混合培養(yǎng),培養(yǎng)時間為經(jīng)預實驗確定的64h,流式細胞學檢測細胞表面CD68分子、CDl63分子和CD80分子的表達以進行巨噬細胞分型,其中CD68分子標記巨噬細胞,CD80標記M1型巨噬細胞,CD163分子標記M2型巨噬細胞;ELISA法測定培養(yǎng)液中的白細胞介素-10(interleukin-10,IL-10)、白細胞介素-12(interleukin-12,IL-12)、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的含量;上述培養(yǎng)液采用MTS法檢測對淋巴細胞轉(zhuǎn)化的作用;不同p H值下混合培養(yǎng)MTS法測定Tca8113細胞的增殖。3、通過10%HCl調(diào)整單核-巨噬細胞系THP-1細胞培養(yǎng)液的p H值分別為7.2、6.8、6.6,進行24h、48h、72h的培養(yǎng),分別加入不同濃度TP,ELISA法檢測培養(yǎng)液中VEGF和血管內(nèi)皮生長因子-C(vascular endothelial growth factor,VEGF-C)的含量;4、提取人外周血單核細胞,調(diào)整細胞培養(yǎng)液的p H值分別為7.2、7.0、6.8、6.6,加入不同濃度的TP,培養(yǎng)64h,流式細胞學檢測細胞表面CD68分子、CDl63分子和CD80分子的陽性及陰性以進行單核-巨噬細胞分型,ELISA法測定培養(yǎng)液中的IL-10、IL-12的含量,收集上述培養(yǎng)液采用MTS法檢測對淋巴細胞轉(zhuǎn)化的作用;在單核-巨噬細胞與Tca8113細胞混合培養(yǎng)液中加入上述不同濃度的TP,MTS法測定Tca8113細胞增殖情況,設(shè)Tca8113細胞加入不同濃度TP作為對照。結(jié)果:1、p H值為7.2、7.0、6.8、6.6時,Tca-8113細胞OD值分別為2.722±0.039、2.828±0.048、2.884±0.010、2.896±0.022,各組間有顯著性差異(P0.05),培養(yǎng)液中IL-8含量分別為192.8±3.5、205.9±0.7、208.6±0.5、216.4±3.9ng/L,各組間有顯著性差異(P0.05),MCP-1含量分別為33.74±0.27、33.82±0.41、34.07±0.41、34.77±0.45ng/L,差異有顯著性(P0.05),HIF-1含量分別為36.63±0.11、37.78±1.05、37.71±0.74、128.90±2.97ng/L,各組間有顯著性差異(P0.05)。2、單核-巨噬細胞單獨培養(yǎng)組中,p H值為7.2、7.0、6.8、6.6時,CD68+單核-巨噬細胞分別為97.65%、97.50%、97.09%、98.84%,差異沒有顯著性(P0.01);CD68+CD163+單核-巨噬細胞(M2型巨噬細胞)分別為2.61%、2.73%、2.71%、6.40%,其中p H值6.6時高于p H值7.2、7.0、6.8時,差異有顯著性(P0.01);CD68+CD80+單核-巨噬細胞(M1型巨噬細胞)分別為3.77%、6.60%、5.82%、17.74%,其中p H值6.6時高于p H值7.2、7.0、6.8時,差異有顯著性(P0.01);培養(yǎng)液中代表M2型巨噬細胞分泌的IL-10含量分別為37.26±0.17、37.22±0.17、38.57±1.50、39.63±0.83ng/L,差異有顯著性(P0.05);VEGF分別為103.0±1.2、102.5±0.5、106.5±2.1、110.3±4.8pg/L,差異有顯著性(P0.05);培養(yǎng)液中代表M1巨噬細胞分泌的IL-12含量分別為5.939±0.024、5.925±0.048、5.884±0.024、5.842±0.048ng/L,差異有顯著性(P0.05)。單核-巨噬細胞與腫瘤細胞混合培養(yǎng)組中,p H值為7.2、7.0、6.8、6.6時,CD68+單核-巨噬細胞分別為98.00%、95.66%、97.07%、99.37%,p H值6.6時與p H值7.0時差異有顯著性(P0.01),相同p H值時與單獨單核-巨噬細胞培養(yǎng)組差異沒有顯著性(P0.01);CD68+CD163+單核-巨噬細胞(M2型巨噬細胞)分別為1.81%、2.94%、3.46%、5.67%,其中p H值6.8時與p H值7.2、7.0時比較及p H值6.6時與其它p H值時比較,差異有顯著性(P0.01),p H6.8時其比率高于而p H6.6低于單獨單核-巨噬細胞培養(yǎng)組,差異有顯著性(P0.01);CD68+CD80+單核-巨噬細胞(M1型巨噬細胞)分別為5.88%、10.10%、10.72%、14.09%,差異有顯著性(P0.01),p H7.0、6.8時其比率高于而p H6.6低于單獨單核-巨噬細胞培養(yǎng)組,差異有顯著性(P0.01);培養(yǎng)液中代表M2型巨噬細胞分泌的IL-10含量分別為37.10±0.55、37.34±0.55、54.63±0.41、56.16±0.93ng/L,差異有顯著性差異(P0.05);VEGF分別為171.7±0.9、173.3±1.2、173.0±0.8、177.4±2.5pg/L,差異有顯著性(P0.05),培養(yǎng)液中代表M1巨噬細胞分泌的IL-12含量分別為9.703±0.080、9.730±0.023、9.556±0.129、9.490±0.122ng/L,差異有顯著性(P0.05)。3、在相同p H值時隨著TP濃度的增加THP-1細胞培養(yǎng)液中VEGF、VEGF-C含量減少,差異有顯著性(p0.05),p H值6.6及TP濃度50ug/ml時最低(p0.05)。4、酸性微環(huán)境下經(jīng)TP干預后,與不加TP相比,加入不同濃度TP后M1型巨噬細胞比率增加,而且隨TP濃度上升比率增加,差異有顯著性(p0.01),TP在較低濃度(10-25μg/ml)M2型巨噬細胞比率有增加,差異有顯著性(p0.01),在較高濃度50-100μg/ml時M2型巨噬細胞比率明顯減少,差異有顯著性(p0.01);析因方差分析顯示,在不同p H值下隨TP濃度的增加細胞培養(yǎng)液中IL-10的含量均出現(xiàn)減少(p0.01),而IL-12含量隨TP濃度的增加均出現(xiàn)增加(p0.01),TP濃度為50μg/ml、100μg/ml時細胞培養(yǎng)液中IL-12較TP濃度為10μg/ml、25μg/ml時增加明顯(p0.05);不同p H值時加入不同濃度的TP的細胞培養(yǎng)液明顯增加了淋巴細胞的轉(zhuǎn)化,并隨濃度的上升作用增強(p0.05)。單獨應用TP在低濃度時(10μg/ml和25μg/ml)Tca8113細胞數(shù)量有增加,而在高濃度(50μg/ml和100μg/ml)時Tca8113細胞數(shù)量明顯減少(p0.05);與單核-巨噬細胞聯(lián)合加入不同濃度的TP均使Tca8113細胞數(shù)量明顯減少,且隨濃度增加而減少明顯(p0.05)。結(jié)論:1、Tca8113細胞能夠通過自身的改變更好的適應酸性微環(huán)境,上調(diào)多種對單核-巨噬細胞具有趨化作用的因子,Tca8113細胞能夠作為研究酸性微環(huán)境對腫瘤細胞及非腫瘤細胞影響的研究對象;2、酸性微環(huán)境可以使單核細胞向M1和M2型巨噬細胞兩極分化,但表現(xiàn)為M2型巨噬細胞的功能狀態(tài),從而更多的促進腫瘤細胞的生長,酸性微環(huán)境可能是腫瘤內(nèi)浸潤的巨噬細胞出現(xiàn)促瘤作用的直接因素之一;3、在酸性微環(huán)境下,低濃度TP就能促使單核細胞更多的向M1型巨噬細胞轉(zhuǎn)化,并表現(xiàn)為M1型巨噬細胞的功能狀態(tài),產(chǎn)生明顯的抑制腫瘤細胞增殖的作用,TP可以作為以腫瘤內(nèi)浸潤的巨噬細胞為靶點的抗腫瘤藥物研發(fā)的研究方向,但其機制及如何有效利用TP調(diào)節(jié)單核-巨噬細胞分化及功能狀態(tài)而達到抗腫瘤的目的還需要更多的研究。

【關(guān)鍵詞】：
【學位授予單位】：貴陽醫(yī)學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R730.2
【目錄】：

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