發(fā)布時(shí)間：2017-12-23 10:49

  本文關(guān)鍵詞：PEDV檢測(cè)納米PCR方法的建立及其分子流行病學(xué)調(diào)查　出處：《黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：豬流行性腹瀉(Porcine epidemic diarrhea,PED)是由豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起,病毒粒子呈圓形或橢圓形,屬于冠狀病毒科,表面有囊膜,囊膜上有放射狀纖突,囊膜內(nèi)為核衣殼蛋白與RNA形成的蜷曲纏繞狀結(jié)構(gòu)。PEDV能夠引起各個(gè)年齡階段的豬感染,豬是唯一的感染動(dòng)物,臨床癥狀與傳染性胃腸炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)引起的癥狀類似,主要包括腹瀉、嘔吐、厭食、脫水及體重減輕等,仔豬的臨床癥狀較為嚴(yán)重,出現(xiàn)大量的死亡,死亡率最高可達(dá)100%,給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。納米PCR方法是一種新型的PCR方法,目前研究較少,雖然不能夠?qū)Σ《具M(jìn)行定量分析,但相較于普通PCR具有靈敏度高,特異性好的特點(diǎn),并且比熒光定量PCR成本低,對(duì)設(shè)備要求低。所以本實(shí)驗(yàn)建立區(qū)分PEDV及TGEV的高效納米PCR方法,能夠快速、敏感、早期的區(qū)分鑒定PEDV或TGEV的感染。根據(jù)已經(jīng)報(bào)道的PEDV及TGEV的N基因的序列設(shè)計(jì)兩對(duì)引物分別擴(kuò)增全長(zhǎng)N基因,連接至p MD18-T載體上作為標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒。設(shè)計(jì)合成特異性的引物,以重組質(zhì)粒為模板,對(duì)退火溫度和引物加入量進(jìn)行條件優(yōu)化。靈敏性實(shí)驗(yàn)表明建立的納米PCR方法比普通PCR方法敏感10倍,質(zhì)粒PEDV-N、TGEV-N模板的最低檢出量分別為7.6×101copies/μL、8.5×101copies/μL,病毒RNA的最低檢出量為2.4×10-3μg/m L和1.7×10-2μg/m L;特異性結(jié)果表明不存在交叉反應(yīng)。利用建立的納米PCR方法對(duì)來自全國(guó)8個(gè)省份的121份臨床樣品進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果發(fā)現(xiàn)PEDV的陽性感染率較高達(dá)到45.45%,TGEV感染較少。與普通PCR相比較,納米PCR能檢出的病毒載量更低。設(shè)計(jì)引物分別擴(kuò)增PEDV的S和ORF3基因,并進(jìn)行序列分析和系統(tǒng)發(fā)育樹分析;S基因的長(zhǎng)度不同,且存在氨基酸的插入與缺失,點(diǎn)突變較多,系統(tǒng)發(fā)育樹分析發(fā)現(xiàn),所得到的毒株均與當(dāng)前流行的毒株類似為變異株。ORF3基因長(zhǎng)度不變,氨基酸上存在多個(gè)共有的突變位點(diǎn),系統(tǒng)發(fā)育樹分析發(fā)現(xiàn),所得到的毒株分屬于不同的進(jìn)化關(guān)系。利用納米PCR的敏感性的特點(diǎn),建立鑒定PEDV的高效納米PCR方法并用于臨床診斷和流行病學(xué)調(diào)查,為PEDV的早期診斷提供新的方法;通過對(duì)PEDV的S及ORF3基因的動(dòng)態(tài)檢測(cè),有利于對(duì)不同地區(qū)的PEDV的流行情況的了解,為疫苗的研發(fā)和疾病的預(yù)防提供有效的信息。
【學(xué)位授予單位】：黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S858.28

【參考文獻(xiàn)】

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3 孫東波;馮力;時(shí)洪艷;劉勝旺;陳洪巖;佟有恩;李偉杰;王明;馬思奇;陳建飛;;豬傳染性胃腸炎病毒重組N蛋白抗原間接ELISA抗體檢測(cè)方法的建立[J];中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào);2006年05期

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本文編號(hào)：1323600