發(fā)布時間：2017-12-23 10:49

  本文關鍵詞：PEDV檢測納米PCR方法的建立及其分子流行病學調(diào)查　出處：《黑龍江八一農(nóng)墾大學》2017年碩士論文　論文類型：學位論文

  更多相關文章： 豬流行性腹瀉 N基因 納米PCR 流行病學調(diào)查 S基因 ORF3基因

【摘要】：豬流行性腹瀉(Porcine epidemic diarrhea,PED)是由豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起,病毒粒子呈圓形或橢圓形,屬于冠狀病毒科,表面有囊膜,囊膜上有放射狀纖突,囊膜內(nèi)為核衣殼蛋白與RNA形成的蜷曲纏繞狀結(jié)構(gòu)。PEDV能夠引起各個年齡階段的豬感染,豬是唯一的感染動物,臨床癥狀與傳染性胃腸炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)引起的癥狀類似,主要包括腹瀉、嘔吐、厭食、脫水及體重減輕等,仔豬的臨床癥狀較為嚴重,出現(xiàn)大量的死亡,死亡率最高可達100%,給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失。納米PCR方法是一種新型的PCR方法,目前研究較少,雖然不能夠?qū)Σ《具M行定量分析,但相較于普通PCR具有靈敏度高,特異性好的特點,并且比熒光定量PCR成本低,對設備要求低。所以本實驗建立區(qū)分PEDV及TGEV的高效納米PCR方法,能夠快速、敏感、早期的區(qū)分鑒定PEDV或TGEV的感染。根據(jù)已經(jīng)報道的PEDV及TGEV的N基因的序列設計兩對引物分別擴增全長N基因,連接至p MD18-T載體上作為標準質(zhì)粒。設計合成特異性的引物,以重組質(zhì)粒為模板,對退火溫度和引物加入量進行條件優(yōu)化。靈敏性實驗表明建立的納米PCR方法比普通PCR方法敏感10倍,質(zhì)粒PEDV-N、TGEV-N模板的最低檢出量分別為7.6×101copies/μL、8.5×101copies/μL,病毒RNA的最低檢出量為2.4×10-3μg/m L和1.7×10-2μg/m L;特異性結(jié)果表明不存在交叉反應。利用建立的納米PCR方法對來自全國8個省份的121份臨床樣品進行檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn)PEDV的陽性感染率較高達到45.45%,TGEV感染較少。與普通PCR相比較,納米PCR能檢出的病毒載量更低。設計引物分別擴增PEDV的S和ORF3基因,并進行序列分析和系統(tǒng)發(fā)育樹分析;S基因的長度不同,且存在氨基酸的插入與缺失,點突變較多,系統(tǒng)發(fā)育樹分析發(fā)現(xiàn),所得到的毒株均與當前流行的毒株類似為變異株。ORF3基因長度不變,氨基酸上存在多個共有的突變位點,系統(tǒng)發(fā)育樹分析發(fā)現(xiàn),所得到的毒株分屬于不同的進化關系。利用納米PCR的敏感性的特點,建立鑒定PEDV的高效納米PCR方法并用于臨床診斷和流行病學調(diào)查,為PEDV的早期診斷提供新的方法;通過對PEDV的S及ORF3基因的動態(tài)檢測,有利于對不同地區(qū)的PEDV的流行情況的了解,為疫苗的研發(fā)和疾病的預防提供有效的信息。
【學位授予單位】：黑龍江八一農(nóng)墾大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：S858.28

【參考文獻】

相關期刊論文 前5條

1 毛雅元;張桂紅;葛俊偉;姜艷平;喬薪瑗;崔文;李一經(jīng);;豬流行性腹瀉病毒地方株LJB/03分離及培養(yǎng)特性[J];病毒學報;2010年06期

2 孫東波;陳建飛;時洪艷;申識川;呂茂杰;范秀萍;陳洪巖;馮力;;豬流行性腹瀉病毒S蛋白受體結(jié)合域的分析[J];畜牧獸醫(yī)學報;2009年04期

3 孫東波;馮力;時洪艷;劉勝旺;陳洪巖;佟有恩;李偉杰;王明;馬思奇;陳建飛;;豬傳染性胃腸炎病毒重組N蛋白抗原間接ELISA抗體檢測方法的建立[J];中國預防獸醫(yī)學報;2006年05期

4 馮力,時洪艷,陳建飛;豬病毒性腹瀉疾病的預防[J];養(yǎng)豬;2005年05期

5 王繼科，馬思奇，，王明，劉長明，魏鳳祥，于文濤，周金法;豬流行性腹瀉與豬傳染性胃腸炎病毒的電鏡和免疫電鏡觀察[J];中國預防獸醫(yī)學報;1999年03期

本文編號：1323600