木薯MeMYB2轉(zhuǎn)錄因子功能研究
發(fā)布時(shí)間：2020-12-08 05:17
木薯（Manihot esculenta Crantz）屬于熱帶農(nóng)作物,主要種植地區(qū)分布在廣州、廣西、海南、福建、云南等省份。木薯根系發(fā)達(dá),具有耐貧瘠和耐旱等特點(diǎn),對(duì)熱帶間接性干旱和低溫具有獨(dú)特的響應(yīng)機(jī)制。因此,剖析熱帶作物對(duì)低溫和干旱脅迫的應(yīng)答機(jī)制,對(duì)提高我國熱帶作物產(chǎn)量和品質(zhì)具有重大意義。本課題在前期研究中,利用高通量測(cè)序和轉(zhuǎn)錄組分析等方法,篩選干旱和低溫脅迫響應(yīng)相關(guān)MeMYB2基因。利用實(shí)時(shí)定量熒光定量PCR檢測(cè),在不同脅迫處理下MeMYB2基因在木薯中的表達(dá)進(jìn)行分析;采用GFP融合表達(dá)技術(shù),確定MeMYB2基因的亞細(xì)胞定位;分段克隆MeMYB2基因,確定MeMYB2基因的自激活活性的具體位置;通過酵母雙雜交技術(shù)、雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù),篩選MeMYB2上游的互作蛋白并確定互作蛋白的關(guān)系;通過酵母單雜交技術(shù),篩選MeMYB2調(diào)控的下游靶基因。研究結(jié)果為進(jìn)一步闡明MeMYB2的功能和分子表達(dá)機(jī)制奠定基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下:實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果表明,MeMYB2可能不參與ABA脅迫響應(yīng)信號(hào);在干旱脅迫處理下,木薯MeMYB2基因受干旱脅迫誘導(dǎo)顯著下調(diào)。通過測(cè)定MeMYB2-RNAi轉(zhuǎn)基...
【文章來源】：黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)黑龍江省
【文章頁數(shù)】：91 頁
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【部分圖文】：
木薯SC124和Arg7葉片中MeMYB2基因在干旱脅迫下表達(dá)量變化
木薯MeMYB2轉(zhuǎn)錄因子功能研究30圖3-2木薯葉片中MeMYB2基因在ABA濃度脅迫下基因表達(dá)量變化Fig3-2ExpressionanalysisofMeMYB2geneincassavaleavesunderexogenousABAtreatment注：A：木薯SC124葉片MeMYB2在不同濃度ABA處理下表達(dá)量變化，用沒有處理的葉片的表達(dá)量為空白對(duì)照；B、C：木薯葉片中Arg7和SC124葉片中MeMYB2基因在50μMABA濃度處理下分別在1、3、6h后表達(dá)量分析；用沒有處理的葉片在1h后表達(dá)量為空白對(duì)照3.1.1.3干旱脅迫下對(duì)木薯葉片保水率影響在植物葉片離體時(shí)，測(cè)定植物葉片的失水率來表示植物抗旱能力的一項(xiàng)指標(biāo)，因此植物葉片失水率越高，說明干旱脅迫處理下葉片自然狀態(tài)下失水的量比正常處理葉片要多，葉片的抵抗干旱能力弱，表現(xiàn)對(duì)干旱脅迫不敏感，失水率越高表明葉片保水率越差，失水率低說明植物葉片保水率強(qiáng)，提高植物抗旱耐受力。結(jié)果表明，如圖（3-3），在室內(nèi)自然放置12h之后葉片失水率表型和失水率折線圖，表明隨著葉片在室溫放置的時(shí)間延長，干旱脅迫下的野生型木薯葉片失水率漸漸增加，轉(zhuǎn)基因木薯葉片失水率低于野生型木薯葉片，說明在干旱脅迫下轉(zhuǎn)基因木薯葉片保存率增強(qiáng)，表現(xiàn)對(duì)干旱的適應(yīng)性更強(qiáng)。
結(jié)果分析31圖3-3干旱脅迫處理下木薯葉片離體時(shí)間葉片失水率Fig3-3Invitroleafwaterlossrateofcassavaleafunderdroughtstress3.1.2MeMYB2亞細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn)室前期通過RNA-Seq結(jié)果表明，MeMYB2屬于R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子。大部分轉(zhuǎn)錄因子定位在細(xì)胞核中，推測(cè)MeMYB2轉(zhuǎn)錄因子編碼基因大概定位在細(xì)胞核內(nèi)。為了準(zhǔn)確的判斷MeMYB2基因的定位，除去MeMYB2基因的終止密碼子的ORF編碼框，利用SalI和BamHI將酶切正確的MeMYB2基因序列插入H3:G1300植物表達(dá)載，與標(biāo)記基因GFP（綠色熒光蛋白）融合，成功構(gòu)建35S:MeMYB2:GFP植物表達(dá)載體。以H3:G1300空載為對(duì)照（本實(shí)驗(yàn)保存），分別轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404，利用農(nóng)桿菌LBA4404介導(dǎo)瞬時(shí)轉(zhuǎn)化本氏煙草。在30°C以下放置40h之后，觀察煙草表皮細(xì)胞，在激光共聚焦顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白的具體位置。結(jié)果如圖3-4所示，注射35S:MeMYB2:GFP融合蛋白在中煙草表皮細(xì)胞在細(xì)胞核中有熒光信號(hào)，陽性對(duì)照載體35S:GFP在細(xì)胞中存在大量的熒光，瞬時(shí)轉(zhuǎn)化不能準(zhǔn)確判斷細(xì)胞的的穩(wěn)定定位，所以推測(cè)MeMYB2可能在細(xì)胞核中表達(dá)的蛋白，在細(xì)胞核中起轉(zhuǎn)錄表達(dá)作用。
【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]蘋果MdMYB2基因的克隆及功能鑒定[J]. 曲豐佳,安建平,姚繼芳,李浩浩,李媛媛,由春香,王小非,郝玉金. 園藝學(xué)報(bào). 2017(12)
[2]能源木薯高淀粉抗逆分子育種研究進(jìn)展與展望[J]. 張鵬,楊俊,周文智,王紅霞,馬秋香. 生命科學(xué). 2014(05)
[3]DREB1B基因在轉(zhuǎn)基因小麥后代的穩(wěn)定表達(dá)[J]. 榮紅穎,張立全,楊鳳萍,陳緒清,張曉東,郭新梅. 分子植物育種. 2009(03)
[4]我國的木薯優(yōu)勢(shì)區(qū)域概述[J]. 黃潔,李開綿,葉劍秋,覃漢林,邵乃凡,陳明育. 廣西農(nóng)業(yè)科學(xué). 2008(01)
[5]外源脫水應(yīng)答轉(zhuǎn)錄因子DREB基因在轉(zhuǎn)基因小麥中的誘導(dǎo)型表達(dá)與抗干旱生理效果研究(英文)[J]. 王軍衛(wèi),楊鳳萍,陳緒清,梁榮奇,張立全,耿東梅,張曉東,宋亞珍,張改生. 遺傳學(xué)報(bào). 2006(05)
[6]Improvement of wheat drought and salt tolerance by expression of a stress- inducible transcription factorGmDREB of soybean （Glycinemax）[J]. GAO Shiqing1, XU Huijun1, CHENG Xianguo2, CHEN Ming1, XU Zhaoshi1, LI Liancheng1, YE Xingguo1, DU Lipu1, HAO Xiaoyan1 & MA Youzhi11. Key Laboratory of Crop Genetics and Breeding, Ministry of Agricul-ture/Institute of Crop Science, Chinese Academy of AgriculturaSciences, Beijing 100081, China; 2. Ministry of Agriculture Key Laboratory of Plant Nutrition and NutrienCycling, Institute of Agricultaral Resources and Regional PlanningChinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China. Chinese Science Bulletin. 2005(23)
博士論文
[1]外源脫水應(yīng)答轉(zhuǎn)錄因子DREB1B和CBF1基因在轉(zhuǎn)基因小麥中表達(dá)研究[D]. 王軍衛(wèi).西北農(nóng)林科技大學(xué) 2005
碩士論文
[1]廣西木薯的抗寒性與抗寒育種的初步研究[D]. 但忠.海南大學(xué) 2010
[2]水稻MYB家族轉(zhuǎn)錄因子OsMYB2的功能研究[D]. 張揚(yáng).揚(yáng)州大學(xué) 2008
本文編號(hào)：2904525
【文章來源】：黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)黑龍江省
【文章頁數(shù)】：91 頁
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【部分圖文】：
木薯SC124和Arg7葉片中MeMYB2基因在干旱脅迫下表達(dá)量變化
木薯MeMYB2轉(zhuǎn)錄因子功能研究30圖3-2木薯葉片中MeMYB2基因在ABA濃度脅迫下基因表達(dá)量變化Fig3-2ExpressionanalysisofMeMYB2geneincassavaleavesunderexogenousABAtreatment注：A：木薯SC124葉片MeMYB2在不同濃度ABA處理下表達(dá)量變化，用沒有處理的葉片的表達(dá)量為空白對(duì)照；B、C：木薯葉片中Arg7和SC124葉片中MeMYB2基因在50μMABA濃度處理下分別在1、3、6h后表達(dá)量分析；用沒有處理的葉片在1h后表達(dá)量為空白對(duì)照3.1.1.3干旱脅迫下對(duì)木薯葉片保水率影響在植物葉片離體時(shí)，測(cè)定植物葉片的失水率來表示植物抗旱能力的一項(xiàng)指標(biāo)，因此植物葉片失水率越高，說明干旱脅迫處理下葉片自然狀態(tài)下失水的量比正常處理葉片要多，葉片的抵抗干旱能力弱，表現(xiàn)對(duì)干旱脅迫不敏感，失水率越高表明葉片保水率越差，失水率低說明植物葉片保水率強(qiáng)，提高植物抗旱耐受力。結(jié)果表明，如圖（3-3），在室內(nèi)自然放置12h之后葉片失水率表型和失水率折線圖，表明隨著葉片在室溫放置的時(shí)間延長，干旱脅迫下的野生型木薯葉片失水率漸漸增加，轉(zhuǎn)基因木薯葉片失水率低于野生型木薯葉片，說明在干旱脅迫下轉(zhuǎn)基因木薯葉片保存率增強(qiáng)，表現(xiàn)對(duì)干旱的適應(yīng)性更強(qiáng)。
結(jié)果分析31圖3-3干旱脅迫處理下木薯葉片離體時(shí)間葉片失水率Fig3-3Invitroleafwaterlossrateofcassavaleafunderdroughtstress3.1.2MeMYB2亞細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn)室前期通過RNA-Seq結(jié)果表明，MeMYB2屬于R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子。大部分轉(zhuǎn)錄因子定位在細(xì)胞核中，推測(cè)MeMYB2轉(zhuǎn)錄因子編碼基因大概定位在細(xì)胞核內(nèi)。為了準(zhǔn)確的判斷MeMYB2基因的定位，除去MeMYB2基因的終止密碼子的ORF編碼框，利用SalI和BamHI將酶切正確的MeMYB2基因序列插入H3:G1300植物表達(dá)載，與標(biāo)記基因GFP（綠色熒光蛋白）融合，成功構(gòu)建35S:MeMYB2:GFP植物表達(dá)載體。以H3:G1300空載為對(duì)照（本實(shí)驗(yàn)保存），分別轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404，利用農(nóng)桿菌LBA4404介導(dǎo)瞬時(shí)轉(zhuǎn)化本氏煙草。在30°C以下放置40h之后，觀察煙草表皮細(xì)胞，在激光共聚焦顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白的具體位置。結(jié)果如圖3-4所示，注射35S:MeMYB2:GFP融合蛋白在中煙草表皮細(xì)胞在細(xì)胞核中有熒光信號(hào)，陽性對(duì)照載體35S:GFP在細(xì)胞中存在大量的熒光，瞬時(shí)轉(zhuǎn)化不能準(zhǔn)確判斷細(xì)胞的的穩(wěn)定定位，所以推測(cè)MeMYB2可能在細(xì)胞核中表達(dá)的蛋白，在細(xì)胞核中起轉(zhuǎn)錄表達(dá)作用。
【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]蘋果MdMYB2基因的克隆及功能鑒定[J]. 曲豐佳,安建平,姚繼芳,李浩浩,李媛媛,由春香,王小非,郝玉金. 園藝學(xué)報(bào). 2017(12)
[2]能源木薯高淀粉抗逆分子育種研究進(jìn)展與展望[J]. 張鵬,楊俊,周文智,王紅霞,馬秋香. 生命科學(xué). 2014(05)
[3]DREB1B基因在轉(zhuǎn)基因小麥后代的穩(wěn)定表達(dá)[J]. 榮紅穎,張立全,楊鳳萍,陳緒清,張曉東,郭新梅. 分子植物育種. 2009(03)
[4]我國的木薯優(yōu)勢(shì)區(qū)域概述[J]. 黃潔,李開綿,葉劍秋,覃漢林,邵乃凡,陳明育. 廣西農(nóng)業(yè)科學(xué). 2008(01)
[5]外源脫水應(yīng)答轉(zhuǎn)錄因子DREB基因在轉(zhuǎn)基因小麥中的誘導(dǎo)型表達(dá)與抗干旱生理效果研究(英文)[J]. 王軍衛(wèi),楊鳳萍,陳緒清,梁榮奇,張立全,耿東梅,張曉東,宋亞珍,張改生. 遺傳學(xué)報(bào). 2006(05)
[6]Improvement of wheat drought and salt tolerance by expression of a stress- inducible transcription factorGmDREB of soybean （Glycinemax）[J]. GAO Shiqing1, XU Huijun1, CHENG Xianguo2, CHEN Ming1, XU Zhaoshi1, LI Liancheng1, YE Xingguo1, DU Lipu1, HAO Xiaoyan1 & MA Youzhi11. Key Laboratory of Crop Genetics and Breeding, Ministry of Agricul-ture/Institute of Crop Science, Chinese Academy of AgriculturaSciences, Beijing 100081, China; 2. Ministry of Agriculture Key Laboratory of Plant Nutrition and NutrienCycling, Institute of Agricultaral Resources and Regional PlanningChinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China. Chinese Science Bulletin. 2005(23)
博士論文
[1]外源脫水應(yīng)答轉(zhuǎn)錄因子DREB1B和CBF1基因在轉(zhuǎn)基因小麥中表達(dá)研究[D]. 王軍衛(wèi).西北農(nóng)林科技大學(xué) 2005
碩士論文
[1]廣西木薯的抗寒性與抗寒育種的初步研究[D]. 但忠.海南大學(xué) 2010
[2]水稻MYB家族轉(zhuǎn)錄因子OsMYB2的功能研究[D]. 張揚(yáng).揚(yáng)州大學(xué) 2008
本文編號(hào)：2904525
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