馬鈴薯M病毒和馬鈴薯A病毒單克隆抗體的創(chuàng)制及血清學(xué)檢測技術(shù)
發(fā)布時(shí)間:2020-12-13 15:48
馬鈴薯是小麥、水稻和玉米之后的世界第四大糧食作物,但其病毒病嚴(yán)重危害馬鈴薯作物,并構(gòu)成重大的產(chǎn)量和經(jīng)濟(jì)損失。馬鈴薯M病毒(Potato virus M,PVM)和馬鈴薯A病毒(Potato virus A,PVA)是兩種重要的馬鈴薯病毒。目前主要是通過種植脫毒苗和無病毒種薯來防控馬鈴薯病毒病,而生產(chǎn)脫毒苗和無毒種薯必須要建立快速簡便、高效靈敏的病毒檢測方法。為此,本論文分別制備出PVM和PVA的單克隆抗體,并以單抗為核心構(gòu)建了三種血清學(xué)檢測方法,從而為PVM和PVA檢測、脫毒種薯種苗的生產(chǎn)及科學(xué)防控體系構(gòu)建提供技術(shù)支持。(1)PVM單克隆抗體的制備及其檢測應(yīng)用:用提純的PVM病毒粒子免疫BALB/c小鼠,使用雜交瘤技術(shù)獲得了4株能穩(wěn)定分泌抗PVM單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株(1E1、2A5、8A1和17G8)。這4株雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的單抗腹水的間接ELISA效價(jià)均達(dá)到10-7。Western blot分析結(jié)果表明4株單抗腹水都與PVM外殼蛋白發(fā)生特異性免疫反應(yīng)。以單抗為核心建立了檢測PVM的三種特異性好和靈敏度高的血清學(xué)方法,即ACP-ELISA、dot-ELISA和T...
【文章來源】:浙江大學(xué)浙江省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校
【文章頁數(shù)】:70 頁
【學(xué)位級(jí)別】:碩士
【部分圖文】:
PVM的基因組結(jié)構(gòu)(引自鄭紅英等,2003)
浙江大學(xué)碩士學(xué)位論文1文獻(xiàn)綜述11體,但體外培養(yǎng)不能長時(shí)間存活。骨髓瘤細(xì)胞可以在體外培養(yǎng)并能不斷繁殖,但是不產(chǎn)生特異性抗體。所以若想要同時(shí)具備分泌抗體和無限繁殖特性的細(xì)胞,可以利用融合劑,將兩種細(xì)胞進(jìn)行融合,得到的雜交瘤細(xì)胞就具備這兩種特性(黃德青,2019)。細(xì)胞融合后,還有大量沒有融合的骨髓瘤細(xì)胞和同一骨髓瘤細(xì)胞融合產(chǎn)物,可以被含氨基喋呤的培養(yǎng)基殺死,使得只有雜交瘤細(xì)胞存活(圖1.3)(Littlefield,1964;李娜,2015)。圖1.3雜交瘤細(xì)胞HAT培養(yǎng)基篩選原理Fig1.3ScreeningprincipleofHATmediumforhybridomacells1.3.2.2兔單克隆抗體技術(shù)的發(fā)展1995年,Spiekerpolet等人首次免疫轉(zhuǎn)基因的兔子,制備出穩(wěn)定的兔雜交瘤細(xì)胞系,使得兔單克隆抗體技術(shù)有了很大的突破性進(jìn)展(Spiekerpoletetal.,1995)。隨后兔單克隆抗體在Pytela等人的努力下產(chǎn)量大幅度增加(Pytelaetal.,2008)。與鼠單克隆抗體相比,它具有很多優(yōu)勢。兔單抗可以識(shí)別包括小鼠體內(nèi)無法產(chǎn)生免疫反應(yīng)的抗原表位;兔抗的親和力高,且具有更高的靈敏度;同時(shí)兔子具有較大的脾臟,能夠進(jìn)行多次免疫融合,有助于高通量篩選出融合細(xì)胞(吳建祥,2008;Fengetal.,2011)。現(xiàn)在兔單克隆抗體的制備技術(shù)日趨成熟,商品化的單抗數(shù)量已有數(shù)千種。其在免疫細(xì)胞化學(xué)和檢測蛋白的轉(zhuǎn)譯后修飾方面有顯著的優(yōu)勢(Huangetal.,1998;Xue.etal.,2001;Taoetal.,2006;),由于兔單抗人源化更容易使得開發(fā)藥物前景更廣闊(李婷婷等,2012)。迄今為止,用于臨床診斷和癌癥研究的兔單克隆抗體已經(jīng)有超過100種(Fletcheretal.,2002;Powelletal.,2007)。
浙江大學(xué)碩士學(xué)位論文2馬鈴薯M病毒單克隆抗體的創(chuàng)制及其檢測應(yīng)用18圖2.1蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜示意圖Figure2.1Diagramofproteintransferred5)Westernblot轉(zhuǎn)膜結(jié)束后,用PBST緩沖液漂洗NC膜,除去膜上轉(zhuǎn)移緩沖液;置于PBST緩沖液(含5%脫脂奶粉),37℃封閉30min,目的是將非特異性的蛋白結(jié)合位點(diǎn)全部封閉;在1:5,000倍稀釋PVM單抗中37℃孵育1h;用PBST每3min洗滌1次,共3次;放入1:8,000倍稀釋AP標(biāo)記羊抗鼠IgG二抗中,37℃孵育1h;用PBST洗滌4次,再用PBS洗滌1次;將膜浸入含66μLNBT和33μLBCIP的10mL底物緩沖液中室溫遮光反應(yīng),約5-20min后特異性條帶顯色明顯時(shí)取出膜置于PBS中,終止顯色反應(yīng);干燥膜后拍照記錄。2.1.5血清學(xué)方法的建立及其特性分析2.1.5.1ACP-ELISA的建立及其特性分析和應(yīng)用(一)具體方法步驟:1)包被:將馬鈴薯的葉片樣品充分磨碎后,按1:20(w/v,g/mL)比例加入0.05M碳酸鹽緩沖液(pH9.6)并繼續(xù)勻漿1min,8,000rpm離心3min后取上清得到病毒粗提液。酶標(biāo)板中每孔加入100μL粗提液,37℃溫箱中2h或4℃過夜,包被后用PBST洗滌3次,靜置3min/次;2)封閉:每孔加入PBS封閉液(含3%脫脂奶粉)250μL,37℃溫箱中0.5h后棄封閉液;
【參考文獻(xiàn)】:
期刊論文
[1]一種快速檢測水稻條紋病毒的膠體金免疫層析試紙條的研制(英文)[J]. De-qing HUANG,Rui CHEN,Ya-qin WANG,Jian HONG,Xue-ping ZHOU,Jian-xiang WU. Journal of Zhejiang University-Science B(Biomedicine & Biotechnology). 2019(04)
[2]基于單克隆抗體的檢測馬鈴薯植物中馬鈴薯S病毒的血清學(xué)方法(英文)[J]. Ge SONG,Jia-yu WU,Yan XIE,Yong LIU,Ya-juan QIAN,Xue-ping ZHOU,Jian-xiang WU. Journal of Zhejiang University-Science B(Biomedicine & Biotechnology). 2017(12)
[3]馬鈴薯M病毒衣殼蛋白原核表達(dá)和多克隆抗體制備[J]. 張春雨,李小宇,萬千,夏黎明,王忠偉,王韜遠(yuǎn),王永志. 東北農(nóng)業(yè)科學(xué). 2017(03)
[4]馬鈴薯M病毒生物學(xué)特性研究[J]. 張威,白艷菊,文景芝,范國權(quán),高艷玲,呂典秋,申宇,邱彩玲,張抒,袁紅梅. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào). 2017(01)
[5]馬鈴薯Y病毒單克隆抗體的制備及其檢測應(yīng)用[J]. 宋革,郭玉雙,饒黎霞,周雪平,吳建祥. 浙江大學(xué)學(xué)報(bào)(農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版). 2016(05)
[6]馬鈴薯莖尖分生組織培養(yǎng)技術(shù)[J]. 王航,劉江娜,陳英. 農(nóng)村科技. 2014(05)
[7]馬鈴薯病毒病防治技術(shù)研究進(jìn)展[J]. 苑智華. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué). 2013(25)
[8]馬鈴薯病毒的常用檢測方法[J]. 劉玲玲,韓黎明,張尚智,禹娟紅. 中國馬鈴薯. 2013(04)
[9]寧夏固原地區(qū)馬鈴薯M病毒的檢測鑒定[J]. 張永江,劉忠梅,燕照玲,劉洪義,馬潔,陳林,辛言言,馬云霞. 河南農(nóng)業(yè)科學(xué). 2013(08)
[10]馬鈴薯A病毒液相芯片快速檢測方法的建立[J]. 劉洪義,張永江,劉忠梅,辛言言,李桂芬,張洪祥. 中國農(nóng)學(xué)通報(bào). 2013(15)
博士論文
[1]四種植物病毒單克隆抗體和傳染性法氏囊病病毒疫苗研制及應(yīng)用[D]. 吳建祥.浙江大學(xué) 2008
碩士論文
[1]柑橘黃龍病菌和甘薯莖腐病菌單克隆抗體的制備及應(yīng)用[D]. 黃德青.浙江大學(xué) 2019
[2]大麥黃矮病毒GAV株系和小麥黃花葉病毒單克隆抗體的制備及其應(yīng)用[D]. 李娜.浙江大學(xué) 2015
[3]水稻矮縮病毒和水稻黑條矮縮病毒單克隆抗體的制備及其應(yīng)用[D]. 倪躍群.浙江大學(xué) 2013
本文編號(hào):2914790
【文章來源】:浙江大學(xué)浙江省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校
【文章頁數(shù)】:70 頁
【學(xué)位級(jí)別】:碩士
【部分圖文】:
PVM的基因組結(jié)構(gòu)(引自鄭紅英等,2003)
浙江大學(xué)碩士學(xué)位論文1文獻(xiàn)綜述11體,但體外培養(yǎng)不能長時(shí)間存活。骨髓瘤細(xì)胞可以在體外培養(yǎng)并能不斷繁殖,但是不產(chǎn)生特異性抗體。所以若想要同時(shí)具備分泌抗體和無限繁殖特性的細(xì)胞,可以利用融合劑,將兩種細(xì)胞進(jìn)行融合,得到的雜交瘤細(xì)胞就具備這兩種特性(黃德青,2019)。細(xì)胞融合后,還有大量沒有融合的骨髓瘤細(xì)胞和同一骨髓瘤細(xì)胞融合產(chǎn)物,可以被含氨基喋呤的培養(yǎng)基殺死,使得只有雜交瘤細(xì)胞存活(圖1.3)(Littlefield,1964;李娜,2015)。圖1.3雜交瘤細(xì)胞HAT培養(yǎng)基篩選原理Fig1.3ScreeningprincipleofHATmediumforhybridomacells1.3.2.2兔單克隆抗體技術(shù)的發(fā)展1995年,Spiekerpolet等人首次免疫轉(zhuǎn)基因的兔子,制備出穩(wěn)定的兔雜交瘤細(xì)胞系,使得兔單克隆抗體技術(shù)有了很大的突破性進(jìn)展(Spiekerpoletetal.,1995)。隨后兔單克隆抗體在Pytela等人的努力下產(chǎn)量大幅度增加(Pytelaetal.,2008)。與鼠單克隆抗體相比,它具有很多優(yōu)勢。兔單抗可以識(shí)別包括小鼠體內(nèi)無法產(chǎn)生免疫反應(yīng)的抗原表位;兔抗的親和力高,且具有更高的靈敏度;同時(shí)兔子具有較大的脾臟,能夠進(jìn)行多次免疫融合,有助于高通量篩選出融合細(xì)胞(吳建祥,2008;Fengetal.,2011)。現(xiàn)在兔單克隆抗體的制備技術(shù)日趨成熟,商品化的單抗數(shù)量已有數(shù)千種。其在免疫細(xì)胞化學(xué)和檢測蛋白的轉(zhuǎn)譯后修飾方面有顯著的優(yōu)勢(Huangetal.,1998;Xue.etal.,2001;Taoetal.,2006;),由于兔單抗人源化更容易使得開發(fā)藥物前景更廣闊(李婷婷等,2012)。迄今為止,用于臨床診斷和癌癥研究的兔單克隆抗體已經(jīng)有超過100種(Fletcheretal.,2002;Powelletal.,2007)。
浙江大學(xué)碩士學(xué)位論文2馬鈴薯M病毒單克隆抗體的創(chuàng)制及其檢測應(yīng)用18圖2.1蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜示意圖Figure2.1Diagramofproteintransferred5)Westernblot轉(zhuǎn)膜結(jié)束后,用PBST緩沖液漂洗NC膜,除去膜上轉(zhuǎn)移緩沖液;置于PBST緩沖液(含5%脫脂奶粉),37℃封閉30min,目的是將非特異性的蛋白結(jié)合位點(diǎn)全部封閉;在1:5,000倍稀釋PVM單抗中37℃孵育1h;用PBST每3min洗滌1次,共3次;放入1:8,000倍稀釋AP標(biāo)記羊抗鼠IgG二抗中,37℃孵育1h;用PBST洗滌4次,再用PBS洗滌1次;將膜浸入含66μLNBT和33μLBCIP的10mL底物緩沖液中室溫遮光反應(yīng),約5-20min后特異性條帶顯色明顯時(shí)取出膜置于PBS中,終止顯色反應(yīng);干燥膜后拍照記錄。2.1.5血清學(xué)方法的建立及其特性分析2.1.5.1ACP-ELISA的建立及其特性分析和應(yīng)用(一)具體方法步驟:1)包被:將馬鈴薯的葉片樣品充分磨碎后,按1:20(w/v,g/mL)比例加入0.05M碳酸鹽緩沖液(pH9.6)并繼續(xù)勻漿1min,8,000rpm離心3min后取上清得到病毒粗提液。酶標(biāo)板中每孔加入100μL粗提液,37℃溫箱中2h或4℃過夜,包被后用PBST洗滌3次,靜置3min/次;2)封閉:每孔加入PBS封閉液(含3%脫脂奶粉)250μL,37℃溫箱中0.5h后棄封閉液;
【參考文獻(xiàn)】:
期刊論文
[1]一種快速檢測水稻條紋病毒的膠體金免疫層析試紙條的研制(英文)[J]. De-qing HUANG,Rui CHEN,Ya-qin WANG,Jian HONG,Xue-ping ZHOU,Jian-xiang WU. Journal of Zhejiang University-Science B(Biomedicine & Biotechnology). 2019(04)
[2]基于單克隆抗體的檢測馬鈴薯植物中馬鈴薯S病毒的血清學(xué)方法(英文)[J]. Ge SONG,Jia-yu WU,Yan XIE,Yong LIU,Ya-juan QIAN,Xue-ping ZHOU,Jian-xiang WU. Journal of Zhejiang University-Science B(Biomedicine & Biotechnology). 2017(12)
[3]馬鈴薯M病毒衣殼蛋白原核表達(dá)和多克隆抗體制備[J]. 張春雨,李小宇,萬千,夏黎明,王忠偉,王韜遠(yuǎn),王永志. 東北農(nóng)業(yè)科學(xué). 2017(03)
[4]馬鈴薯M病毒生物學(xué)特性研究[J]. 張威,白艷菊,文景芝,范國權(quán),高艷玲,呂典秋,申宇,邱彩玲,張抒,袁紅梅. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào). 2017(01)
[5]馬鈴薯Y病毒單克隆抗體的制備及其檢測應(yīng)用[J]. 宋革,郭玉雙,饒黎霞,周雪平,吳建祥. 浙江大學(xué)學(xué)報(bào)(農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版). 2016(05)
[6]馬鈴薯莖尖分生組織培養(yǎng)技術(shù)[J]. 王航,劉江娜,陳英. 農(nóng)村科技. 2014(05)
[7]馬鈴薯病毒病防治技術(shù)研究進(jìn)展[J]. 苑智華. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué). 2013(25)
[8]馬鈴薯病毒的常用檢測方法[J]. 劉玲玲,韓黎明,張尚智,禹娟紅. 中國馬鈴薯. 2013(04)
[9]寧夏固原地區(qū)馬鈴薯M病毒的檢測鑒定[J]. 張永江,劉忠梅,燕照玲,劉洪義,馬潔,陳林,辛言言,馬云霞. 河南農(nóng)業(yè)科學(xué). 2013(08)
[10]馬鈴薯A病毒液相芯片快速檢測方法的建立[J]. 劉洪義,張永江,劉忠梅,辛言言,李桂芬,張洪祥. 中國農(nóng)學(xué)通報(bào). 2013(15)
博士論文
[1]四種植物病毒單克隆抗體和傳染性法氏囊病病毒疫苗研制及應(yīng)用[D]. 吳建祥.浙江大學(xué) 2008
碩士論文
[1]柑橘黃龍病菌和甘薯莖腐病菌單克隆抗體的制備及應(yīng)用[D]. 黃德青.浙江大學(xué) 2019
[2]大麥黃矮病毒GAV株系和小麥黃花葉病毒單克隆抗體的制備及其應(yīng)用[D]. 李娜.浙江大學(xué) 2015
[3]水稻矮縮病毒和水稻黑條矮縮病毒單克隆抗體的制備及其應(yīng)用[D]. 倪躍群.浙江大學(xué) 2013
本文編號(hào):2914790
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