發(fā)布時(shí)間：2024-10-05 06:02

　　大黃魚(Larimichthys crocea)虹彩病毒病是當(dāng)前危害大黃魚養(yǎng)殖業(yè)最為嚴(yán)重的幾種病害之一,多流行于夏季高溫季節(jié),一般幼齡魚多發(fā),死亡率最高可達(dá)50%以上,該病目前尚無(wú)有效的針對(duì)性治療方法。近年在大黃魚生產(chǎn)實(shí)際中,饑餓療法常被運(yùn)用于大黃魚感染虹彩病毒病的治療,本實(shí)驗(yàn)通過(guò)模擬臨床中大黃魚虹彩病毒病饑餓療法試驗(yàn),建立大黃魚人工感染虹彩病毒群體,分別連續(xù)饑餓和投喂一周,采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法在分子水平上開展了不同組織中病毒載量以及相關(guān)免疫因子表達(dá)情況的研究,同時(shí)對(duì)免疫酶、抗氧化酶等指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定分析,研究結(jié)果如下:(1)根據(jù)OIE水生動(dòng)物診斷手冊(cè)推薦的基因序列,成功構(gòu)建虹彩病毒SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法,其最低檢出限為10～2 copies/ng DNA,質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)為99.82%,運(yùn)用該方法對(duì)自然發(fā)病大黃魚體內(nèi)病毒載量進(jìn)行檢測(cè),其主要免疫器官脾臟、頭腎和肝臟中病毒載量分別為8.90×10～4copies/ng DNA、1.86×10～4copies/ng DNA和1.32×10～4copies/ng DNA。(2)通過(guò)腹腔注射虹彩病毒懸液感染健康大...

【文章頁(yè)數(shù)】：75 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
第一章 引言
第二章 虹彩病毒SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.2 主要試劑
        2.1.3 主要儀器設(shè)備
        2.1.4 實(shí)驗(yàn)所用溶液及其配置
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 特異性引物設(shè)計(jì)與合成
        2.2.2 組織DNA提取
        2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的制備
        2.2.4 SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立
        2.2.5 自然發(fā)病大黃魚定性檢測(cè)
        2.2.6 運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量法檢測(cè)自然發(fā)病大黃魚體內(nèi)虹彩病毒載量
        2.2.7 數(shù)據(jù)處理
    2.3 結(jié)果
        2.3.1 虹彩病毒基因片段的克隆及測(cè)序鑒定
        2.3.2 重組質(zhì)粒酶切鑒定及濃度測(cè)定
        2.3.3 熒光定量PCR反應(yīng)條件的確定
        2.3.4 熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立
        2.3.5 自然發(fā)病大黃魚樣品常規(guī)PCR檢測(cè)結(jié)果及qPCR結(jié)果
    2.4 討論與小結(jié)
        2.4.1 小結(jié)
        2.4.2 討論
第三章 大黃魚虹彩病毒人工感染群體建立
    3.1 實(shí)驗(yàn)材料
        3.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
        3.1.2 病毒株
        3.1.3 主要試劑及其配制
        3.1.4 主要儀器
    3.2 實(shí)驗(yàn)方法
        3.2.1 病毒懸液制備
        3.2.2 攻毒試驗(yàn)
        3.2.3 虹彩病毒的PCR檢測(cè)
        3.2.4 組織病理學(xué)切片制備和觀察
    3.3 結(jié)果
        3.3.1 大黃魚人工感染虹彩病毒的臨床癥狀與PCR檢測(cè)
        3.3.2 人工感染的大黃魚組織病理學(xué)變化
        3.3.3 超微組織病理觀察結(jié)果
    3.4 討論與小結(jié)
        3.4.1 小結(jié)
        3.4.2 討論
第四章 饑餓對(duì)人工感染大黃魚體內(nèi)虹彩病毒載量及抗病毒基因表達(dá)的影響
    4.1 實(shí)驗(yàn)材料
        4.1.1 主要試劑
        4.1.2 主要儀器設(shè)備
    4.2 實(shí)驗(yàn)方法
        4.2.1 實(shí)驗(yàn)分組設(shè)計(jì)
        4.2.2 樣本采集
        4.2.3 RT引物設(shè)計(jì)
        4.2.4 DNA提取及濃度測(cè)定
        4.2.5 總RNA提取及cDNA合成
        4.2.6 熒光定量PCR檢測(cè)
        4.2.7 數(shù)據(jù)處理
    4.3 結(jié)果
        4.3.1 饑餓組與投喂組感染后死亡率統(tǒng)計(jì)
        4.3.2 微量分光光度計(jì)檢測(cè)DNA及 RNA純度
        4.3.3 IFNc、Mx和 IgM檢測(cè)引物的熔解曲線分析
        4.3.4 饑餓組與投喂組主要免疫器官中病毒載量的變化
        4.3.5 饑餓組與投喂組主要免疫器官中抗病毒基因的表達(dá)變化
    4.4 討論與小結(jié)
        4.4.1 小結(jié)
        4.4.2 討論
第五章 饑餓對(duì)人工感染大黃魚組織中SOD、CAT、ACP、AKP酶活性的影響
    5.1 實(shí)驗(yàn)材料
        5.1.1 組織樣本
        5.1.2 主要試劑
        5.1.3 主要儀器設(shè)備
    5.2 實(shí)驗(yàn)方法
        5.2.1 酶液的制備
        5.2.2 數(shù)據(jù)處理
    5.3 結(jié)果
        5.3.1 饑餓對(duì)人工感染大黃魚組織內(nèi)SOD活力的影響
        5.3.2 饑餓對(duì)人工感染大黃魚組織內(nèi)CAT活力的影響
        5.3.3 饑餓對(duì)人工感染大黃魚組織內(nèi)ACP活力的影響
        5.3.4 饑餓對(duì)人工感染大黃魚組織內(nèi)AKP活力的影響
    5.4 討論與小結(jié)
        5.4.1 小結(jié)
        5.4.2 討論
總結(jié)與展望
    總結(jié)
    不足和有待進(jìn)一步研究的問題
參考文獻(xiàn)
致謝
在讀期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文及研究成果



本文編號(hào)：4007622