發(fā)布時間：2020-11-20 23:12

　　 研究目的:大面積的燒傷、軟組織創(chuàng)傷和皮膚壞死性疾病會造成真皮缺損,嚴重影響患者的生存質量。組織工程真皮為修復缺損真皮提供了可能。真皮內存在大量的真皮成纖維細胞和臍靜脈內皮細胞,本實驗旨在研究骨髓間充質干細胞、臍靜脈內皮細胞、真皮成纖維細胞在什么樣的比例下聯(lián)合培養(yǎng)可以形成組織工程真皮,以助于未來組織工程真皮的構建。方法:(1)原代人真皮成纖維細胞和人臍靜脈內皮細胞的復蘇、體外培養(yǎng)以及形態(tài)學觀察:10mg/ml poly-L-lysine包被培養(yǎng)瓶,水浴、復蘇原代細胞,倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)和生長情況,選取生長活性較好的細胞用于實驗。(2)兔骨髓間充質干細胞的提取、分離、純化、體外培養(yǎng)以及形態(tài)學的觀察:無菌條件下提取兩周齡新西蘭大白兔雙后肢骨髓,運用全骨髓貼壁法對骨髓間充質干細胞進行分離、純化,顯微鏡下觀察細胞的形態(tài)和生長情況,選取生長活性較好的第三代細胞用于以下實驗。(3)兔骨髓間充質干細胞、人臍靜脈內皮細胞、人真皮成纖維細胞的聯(lián)合培養(yǎng)構建細胞膜片:將兔骨髓間充質干細胞以9×10?cells/cm2的密度接種于六孔板中連續(xù)培養(yǎng)14天,將人臍靜脈內皮細胞以5×10?cell/cm2的密度接種在先前的干細胞膜片上,同時將人真皮成纖維細胞以總細胞數(shù)的0%、40%、60%、80%的比例接種在干細胞膜片上,進行同一條件下的培養(yǎng)。(4)細胞膜片生長情況以及形態(tài)學的觀察:1、3、7、14天時顯微鏡下觀察三種細胞形成細胞膜片的生長情況。(5)細胞膜片厚度的測量:取1、3、7、14天的細胞膜片包埋、制作冰凍切片,HE染色,顯微鏡下觀察并拍照,標尺重復測量膜片厚度。(6)免疫熒光染色及觀察:取1、3、7、14天各組的細胞膜片做CD31的免疫熒光染色,倒置熒光顯微鏡下觀察內皮細胞血管網(wǎng)絡的形成并拍照。(7)免疫組化染色:取1、3、7、14天各組的細胞膜片做Ⅰ型、Ⅲ型膠原的免疫組化染色,倒置顯微鏡下觀察并拍照,IPP6.0圖像分析軟件計算Ⅰ型、Ⅲ型膠原的含量。(9)流式細胞儀鑒定兔骨髓間充質干細胞:取7天各組的細胞膜片用0.25%胰蛋白酶消化成單細胞懸液,CD90染色,流式細胞儀的檢測。(10)用spss23軟件對所得數(shù)據(jù)結果進行單因素方差分析以及t檢驗。實驗結果:(1)原代人臍靜脈內皮細胞和人真皮成纖維細胞復蘇后生長活性較高,形態(tài)良好。(2)通過全骨髓貼壁法獲取的兔骨髓間充質干細胞形態(tài)呈均一的長梭形或多角形,增殖旺盛。(3)1、3、7、14天各組的細胞膜片隨著時間和成纖維細胞比例的增加,細胞排列由疏松有序變得雜亂緊密,細胞間無空隙,第7天時成纖維細胞60%和80%組、第14天時40%和60%組細胞排列雜亂,編織成致密的網(wǎng)絡狀。(4)免疫熒光染色結果:隨著培養(yǎng)時間和成纖維細胞比例的增加,1、3、7、14天各組細胞膜片中內皮細胞形成的血管網(wǎng)絡變得密集,第7天、第14天時成纖維細胞60%、80%組內皮細胞形成的管腔狀結構最為典型。(5)免疫組化染色結果:隨著培養(yǎng)時間和成纖維細胞比例的增加,細胞膜片中的Ⅰ型膠原含量呈現(xiàn)出先增加后減少的趨勢,在第7天時成纖維細胞60%、80%組最接近人類真皮Ⅰ型膠原的含量。類似的,隨著培養(yǎng)時間和成纖維細胞比例的增加,細胞膜片中的Ⅲ型膠原含量也呈現(xiàn)出先增加后減少的趨勢,在第1天和第7天時成纖維細胞60%、80%組最接近人類真皮Ⅲ型膠原的含量。(6)流式細胞儀鑒定結果:在7天的各組細胞膜片中均有CD90標記的干細胞出現(xiàn)。結論:人臍靜脈內皮細胞、兔骨髓間充質干細胞和人真皮成纖維細胞以5:9:21(即成纖維細胞60%組)的比例聯(lián)合培養(yǎng)形成的細胞膜片在培養(yǎng)第7天時具有真皮的部分屬性。
【學位單位】：蘭州大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R329.2
【部分圖文】：

圖 2 人真皮成纖維細胞的形態(tài)（倒置相差顯微鏡）圖注：a 圖為原代人真皮成纖維細胞，細胞呈短梭形、長梭形、多角形和不規(guī)則形；b 圖為第 3 代人真皮成纖維細胞，細胞形態(tài)呈均一的長梭形，少量呈多角形和不規(guī)則形，呈旋渦狀、平行狀、集落樣生長（Scalebar=200um ）。3.2 人臍靜脈內皮細胞的形態(tài)學和生長情況的觀察

圖 3 人臍靜脈內皮細胞（倒置相差顯微鏡）圖注：a 圖為貼壁的原代人臍靜脈內皮細胞，呈卵圓形；b 圖為第 3 代人臍靜脈內皮細胞，細胞呈鵝卵石狀，聚集排列呈鋪路石樣結構（Scale bar=100um ）。3.3 兔骨髓間充質干細胞的形態(tài)學和生長情況觀察

圖 1 兔骨髓間充質干細胞（倒置相差顯微鏡）圖注：a 圖為原代兔間充質干細胞，細胞形態(tài)為長梭形，多角形，少量不規(guī)則形；b 圖為第 3 代兔骨髓間充質干細胞，細胞在培養(yǎng)瓶底壁以旋渦狀排列（Scale bar=200um ）。
【參考文獻】

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本文編號：2892148