發(fā)布時間：2020-11-21 17:43

　　 背景及目的煙曲霉(Aspergillus fumigatus,A.fumigatus)是一種廣泛存在于我們生活環(huán)境中重要致病菌,可以引起人類、畜及禽類的感染,最常見的感染是肺部感染。A.fumigaius可以產(chǎn)生分生孢子,直徑只有2-3μm,被吸入肺部后,可到達肺泡,隨后出芽,產(chǎn)生菌絲,侵犯肺組織。肺部感染可因宿主免疫狀態(tài)、肺部疾病狀況、吸入煙曲霉總量及頻率的不同,產(chǎn)生不同類型的感染,如侵襲性曲霉菌病(invasive pulmonary aspergillosis,IA)、慢性肺曲霉菌病(chronic pulmonary aspergillosis,CPA)、變應(yīng)性支氣管肺曲霉菌病(allergic bronchopulmonary aspergillosis,ABPA)等。其中,IA及ABPA已有較多研究,其發(fā)病機制及治療方法也比較明確,而由于缺少動物模型,CPA的發(fā)病機制及治療手段研究較少。CPA主要發(fā)生于免疫力正常但有基礎(chǔ)肺病(肺結(jié)核)或有輕度免疫力下降的患者。CPA死亡率非常高,已成為全球范圍內(nèi)威脅人類健康的疾病。因此,建立CPA的動物模型勢在必行。之前已有學(xué)者嘗試著建立CPA的模型,他們通過將包裹在瓊脂球中的A.fumigatus孢子接種至小鼠肺部,使之不易被清除,建立了長達28天的肺部煙曲霉感染模型。然而,在這個模型中,包裹在瓊脂球中的煙曲霉無法與免疫細胞進行充分的接觸,且瓊脂本身可引起肺部的免疫反應(yīng),這兩點使得他們所檢測的免疫反應(yīng)出現(xiàn)較大的偏差。在2015年,我們實驗室曾經(jīng)從一名有肺結(jié)核病史的CPA患者肺組織中分離出了一株不產(chǎn)孢、只有菌絲形態(tài)的煙曲霉。此外,由于在CPA病程中,A.fumigatus也主要是以菌絲形態(tài)慢性定植于小鼠肺部,因此建立肺部A.fumigatus菌絲慢性定植的動物模型,對于研究CPA的發(fā)病機制及治療手段的評價具有重要參考意義。此外,既往有研究證明,A.fumigatus孢子及菌絲形態(tài)可引起不同的免疫反應(yīng),但是研究結(jié)果具有較大爭議。因此,我們將建立肺部A.fumigatus菌絲的慢性定植模型來模擬人類CPA。另外我們以小鼠肺部A.fumigatus的孢子感染為對照,研究A.fumigatus孢子及菌絲引起不同的固有免疫及適應(yīng)性免疫反應(yīng)。實驗方法本研究用綠色熒光蛋白(green fluorescence protein,GFP)標記A.fumigatus標準菌株Af293,并將其制作成為直徑在150-250 u m的結(jié)構(gòu)緊密的菌絲球,接種至免疫力正常的小鼠肺部,并通過小鼠肺部活體成像、小鼠肺部病理(PeriodicAcid-Schiff stain,PAS染色)及小鼠肺部真菌負荷檢測Af293在小鼠肺部存留時間,判斷小鼠是否為慢性感染。同時監(jiān)測小鼠體重變化,及一般情況變化,如大小便性狀變化、毛發(fā)變化、肺部癥狀。利用流式細胞儀檢測小鼠肺部A.fumigatus孢子及菌絲形態(tài)感染引起的不同免疫反應(yīng)。實驗結(jié)果1.GFP 標記 Af293 菌株(Af293-GFP)將GFP基因序列轉(zhuǎn)染至Af293菌株的基因序列中,使Af293菌株帶有明亮的綠色熒光,且在小鼠體內(nèi)28天不會淬滅。2.Af293-GFP菌絲球的制作將Af293-GFP菌絲制作成為結(jié)構(gòu)緊密的菌絲球,其直徑為150-250 μm。3.小鼠肺部Af293-GFP分布在對照組,小鼠肺部無熒光;在肺部感染孢子組,小鼠肺部在感染后第1,7天可見綠色熒光,7天之后無熒光;在肺部感染菌絲球組,小鼠肺部在感染后1,7,14,21及28天均可見綠色熒光:在感染后第1天及第7天,小鼠肺部熒光較強;從第14天至21天,小鼠肺部熒光一直較弱;而在感染后第28天,小鼠肺部熒光明顯強于第14天及第21天,且熒光明顯變得彌散。4.小鼠肺部病理結(jié)果(PAS染色)在孢子感染組,感染后第1天,病理結(jié)果可見煙曲霉Af293孢子被巨噬細胞吞噬;感染后第7天,病理結(jié)果顯示氣管腔內(nèi)大量品紅色氣管分泌物;感染后14、21及28天,小鼠病理結(jié)果均未見明顯異常。在菌絲球感染組,菌絲可在小鼠肺部存留長達28天。在小鼠感染菌絲球后第1天,大量的中性粒細胞及巨噬細胞均被募集至感染區(qū);在感染后第7天,氣管腔內(nèi)的菌絲球生長為較大的菌絲塊,充滿支氣管管腔,菌絲塊內(nèi)有大量的中性粒細胞及巨噬細胞浸潤;在感染后第14、21天,管腔內(nèi)大部分煙曲霉菌絲已被清除,且氣管腔壁已被破壞,感染區(qū)被大量巨噬細胞、中性粒細胞及淋巴細胞包饒;感染后第28天,感染區(qū)為大量中性粒細胞、巨噬細胞及淋巴細胞浸潤,肺部出現(xiàn)實變。各個時間點感染病灶局限,均未見菌絲侵襲肺間質(zhì)及肺部血管。這與人類CPA病理表現(xiàn)相類似。5.小鼠肺部真菌負荷在孢子感染組,小鼠肺部真菌負荷逐漸減少。在菌絲球感染組,小鼠肺部真菌負荷在感染后第1天及第7天幾乎維持不變,表明了小鼠肺部煙曲霉在被炎癥細胞吞噬的同時,也有一定的生長;在感染后第14、21天,小鼠肺部真菌負荷維持不變,但相較于第7天明顯下降;而在感染后第28天,小鼠肺部真菌負荷有了較大的增長,表明了小鼠肺部真菌感染出現(xiàn)了復(fù)燃,這與人類CPA具有高復(fù)發(fā)率相吻合。6.小鼠體重變化及一般情況觀察未感染組、孢子感染組及菌絲球感染組的小鼠體重變化趨勢無明顯差異。三組小鼠均未出現(xiàn)大小便性狀變化、皮毛雜亂及喘息等呼吸道癥狀。此外,三組小鼠在接種24小時之后,均未出現(xiàn)死亡。7.固有免疫研究結(jié)果固有免疫主要探究了巨噬細胞及中性粒細胞在煙曲霉感染中的作用。在孢子感染組,接種后支氣管腔內(nèi)出現(xiàn)大量巨噬細胞及少量的中性粒細胞,且在感染后第7天,兩種細胞數(shù)量達到最大值,之后則逐漸降低。在管腔周圍,整個感染過程中均未見巨噬細胞及中性粒細胞浸潤,而在感染后第28天,管腔周圍有少量淋巴細胞浸潤。在菌絲球感染組,感染后支氣管腔內(nèi)聚集有大量巨噬細胞及中性粒細胞,且在感染后第7天數(shù)量達到最大值,隨后逐漸降低。在管腔周圍,同樣有大量巨噬細胞、中性粒細胞及淋巴細胞浸潤。其中,巨噬細胞及淋巴細胞在感染后第1天數(shù)量達到最大值,其后即逐漸下降。而中性粒細胞數(shù)量在感染后第7天達到頂峰,其后逐漸下降。8.適應(yīng)性免疫研究結(jié)果在孢子感染組,Th1、Th2及Th17細胞數(shù)量均從感染后第1天開始增加,至第7天達到最大值,之后逐漸下降,但仍高于未感染組。這與既往研究結(jié)果不相符,而從感染后第1天至第21天,孢子感染組Treg細胞均高于未感染組。在菌絲球感染組,在整個感染過程中,Th1細胞均未見升高,而Th2及Th17細胞在感染后第7天有一過性的升高,后逐漸降低。Treg細胞在感染后第1天即升高,在第7天達到最大值,隨后逐漸降。結(jié)論本研究建立了一個肺部A.fumigatus菌絲慢性定植的小鼠模型來模擬人類CPA,為研究CPA的發(fā)病機制及新的治療方法提供了動物模型,也為不產(chǎn)孢煙曲霉引起的CPA的研究提供了動物模型。此外,此研究也探討了煙曲霉孢子及菌絲引起的不同的免疫反應(yīng)。
【學(xué)位單位】：南京大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R519;R-332
【部分圖文】：

－２０°Ｃ儲存。??３．實驗結(jié)果??３．１插入ＧＦＰ片段引物擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳（見圖２．１），?ＤＮＡ片段長７７９ｂｐ。??■??圖２．１插入ＧＦＰ片段引物擴增產(chǎn)物，ＤＮＡ長度為７７９ｂｐ。??３．２轉(zhuǎn)化后大腸桿菌菌落ＰＣＲ產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳（見圖２．２），ＤＮＡ片段長??１５２５ｂｐ。可見所挑選的１２個菌落均轉(zhuǎn)化成功。??ＢＢＢ８Ｉ??圖２．２?１２個轉(zhuǎn)化后大腸桿菌菌落ＰＣＲ擴增產(chǎn)物，ＤＮＡ長度為１５２５ｂｐ。??３．３熒光顯微鏡下ＧＦＰ陽性／１只９３菌株Ｕ／２９３－ＣＦＰ）（見圖２．３），可觀察到??Ｚ１／２９３－ＧＦＰ菌株的孢子及菌絲均帶有較強的綠色熒光。??４１??

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