發(fā)布時間：2020-12-11 01:36

　　目的本研究旨在構(gòu)建并制備增強(qiáng)型熒光蛋白（EGFP）基因和Klotho基因重組腺病毒載體AdEGFP-Klotho,并將其感染HEK293細(xì)胞,為基因治療提供研究基礎(chǔ)。方法設(shè)計含有NheⅠ與NotⅠ雙酶切位點(diǎn)的引物,應(yīng)用PCR方法擴(kuò)增Klotho基因,將其連接到EGFP標(biāo)記的pDC316-mCMV穿梭質(zhì)粒上,構(gòu)建重組穿梭質(zhì)粒pDC316-mCMV-EGFP-Klotho,利用Polyfectin脂質(zhì)體將骨架質(zhì)粒和重組穿梭質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞進(jìn)行同源重組,得到重組腺病毒Ad-EGFP-Klotho,并包裝擴(kuò)增,測定病毒顆粒數(shù)及滴度。采用PCR方法對重組腺病毒載體Ad-EGFP-Klotho進(jìn)行鑒定,并進(jìn)行Klotho基因測序。結(jié)果經(jīng)PCR和NheⅠ、NotⅠ雙酶切鑒定,重組腺病毒載體Ad-EGFP-Klotho中證實(shí)含有Klotho基因,測序結(jié)果和設(shè)計序列比對一致,重組腺病毒載體Ad-EGFP-Klotho構(gòu)建成功。滴度為2.0×1010 Tu/mL,成功感染HEK293細(xì)胞,感染復(fù)數(shù)（MOI）=100,感染效率達(dá)91.75%,從Ad-EGFP-Klotho重組腺病毒載體中可以檢測到... 

【文章來源】：重慶醫(yī)學(xué). 2019年23期 第3970-3973頁

【文章頁數(shù)】：4 頁

【部分圖文】：

重組穿梭質(zhì)粒pDC316-CMV-EGFP-Klotho酶切鑒定結(jié)果

重組腺病毒Ad-EGFP-Klotho轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，轉(zhuǎn)染8d后細(xì)胞表現(xiàn)出CPE現(xiàn)象，置于熒光顯微鏡下觀察，可見大量表達(dá)EGFP，見圖3。圖3 Klotho和EGFP轉(zhuǎn)染后到獲得重組腺病毒的EGFP表達(dá)圖

Klotho和EGFP轉(zhuǎn)染后到獲得重組腺病毒的EGFP表達(dá)圖

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]重組腺病毒載體Ad5-hTRX-EGFP的構(gòu)建及其表達(dá)[J]. 扈江偉,王軍,徐曼,蘇永鋒,孔維霞,盛紅霞,張斌,陳虎.  中國實(shí)驗血液學(xué)雜志. 2012(03)



本文編號：2909659