發(fā)布時間：2020-11-21 10:48

　　 抗原特異性T淋巴細(xì)胞免疫應(yīng)答的有效產(chǎn)生及維持需要兩種信號――MHC-肽復(fù)合物提供的特異性抗原信號，以及由APC表面共刺激分子提供的共刺激信號(Costimulatory signal)，缺乏共刺激信號的抗原信號往往引起免疫耐受。CD28/CTLA-4－B7.1/B7.2共刺激途徑是最早深入研究的共刺激途徑之一，來自該途徑的共刺激信號對T細(xì)胞的活化和耐受發(fā)揮著重要調(diào)節(jié)作用。但眾多證據(jù)表明CD28并不是唯一的共刺激分子，例如CD28缺失的小鼠仍能產(chǎn)生一定的免疫應(yīng)答[1-4]。同時也有研究表明： T細(xì)胞免疫應(yīng)答后期，來自CD28的共刺激信號對活化后的T細(xì)胞發(fā)揮效應(yīng)并非必不可少，甚至不能稱為主要的信號[5-7]。 隨著基因組計劃的完成，多種具有共刺激效應(yīng)的T細(xì)胞表面受體被發(fā)現(xiàn)，有關(guān)T細(xì)胞活化共刺激信號的研究取得了許多新進(jìn)展。這些研究成果明確了B7-1/B7-2—CD28/CTLA-4和 CD40L-CD40共刺激信號通路在激發(fā)初始T細(xì)胞活化中占主導(dǎo)地位，同時也發(fā)現(xiàn)，大部分效應(yīng)性CD8+和CD4+T細(xì)胞的功能的發(fā)揮和維持，以及記憶性T細(xì)胞發(fā)生再次應(yīng)答并不依賴這兩條共刺激信號通路，提示在T細(xì)胞應(yīng)答的不同時空階段，不同的共刺激信號對T細(xì)胞的功能和效應(yīng)發(fā)揮著各自不同的調(diào)節(jié)作用[6.7]。在初始T細(xì)胞的活化階段，CD28、CD40L的共刺激信號發(fā)揮重要作用，而在記憶和效應(yīng)T細(xì)胞的功能發(fā)揮和維持階段可能還存在其他的免疫分子的參與[8,9]。 最近，ICOS-B7RP-1信號通路在參與調(diào)節(jié)記憶性和效應(yīng)性T細(xì)胞功能、維持外周耐受等方面的功能引起我們極大的關(guān)注。ICOS(Inducible COStimulator，誘導(dǎo)共刺激分子)是CD28家族中繼發(fā)現(xiàn)CD28、CTLA-4之后的第3個成員。ICOS需要TCR信號的誘導(dǎo)，局限表達(dá)于活化后的T細(xì)胞膜上，故命名為誘導(dǎo)共刺激分子[10,11]。其配體ICOSL(B7RP-1，B7H2)是B7家族成員，主要在B細(xì)胞和單核細(xì)胞表達(dá)[12]。目前認(rèn)為ICOS作用于免疫應(yīng)答的效應(yīng)和記憶階段，對已經(jīng)受到抗原刺激的免疫細(xì)胞擴(kuò)增、遷移釋放效應(yīng)性細(xì)胞因子都具有重要的影響[13,14]。此外，ICOS途徑還能上調(diào)T細(xì)胞表面多種趨化因子受體的表達(dá)，并且能促進(jìn)CD40L的表達(dá)，間接增強(qiáng)CD40-CD40L途徑的免疫活化效應(yīng)[15-17]。這些發(fā)現(xiàn)提示，效應(yīng)T細(xì)胞和記憶T細(xì)胞的功能發(fā)揮和維持依賴于ICOS的共刺激信號。此外，多種疾病的動物模型研究表明，以ICOS途徑為靶點的免疫調(diào)節(jié)對自身免疫性疾病和移植免疫的長期耐受形成均有著重要的臨床治療 WP=11 意義[18,19]。 由于ICOS誘導(dǎo)表達(dá)于活化后T細(xì)胞上，并且在效應(yīng)性和記憶性T細(xì)胞功能的發(fā)揮和維持上起著重要作用，因此，干預(yù)ICOS共刺激途徑，可能有助于調(diào)節(jié)主要由活化后T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，如移植免疫中慢性排斥反應(yīng)、I型糖尿病等。基于上述考慮，我們試圖通過單獨(dú)阻斷ICOS共刺激途徑或聯(lián)合干預(yù)其他相關(guān)途徑來研究ICOS對活化后的T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的抑制作用，在本研究中，圍繞制備ICOS共刺激信號的阻斷劑――可溶性融合蛋白分子ICOSIg，主要進(jìn)行了以下幾部分的工作： 1. 人ICOSIg真核表達(dá)載體的構(gòu)建 ⑴人ICOS全長cDNA的克隆及其真核表達(dá)載體的構(gòu)建：采用PCR技術(shù)，從cDNA文庫phAD.CAD擴(kuò)增出人ICOS全長的cDNA序列，定向克隆入真核表達(dá)載體pCI-neo中，酶切測序鑒定，為從細(xì)胞水平研究ICOS的功能奠定了基礎(chǔ)。 ⑵人ICOSIg真核表達(dá)載體的構(gòu)建：利用基因工程技術(shù)將ICOS膜外區(qū)與hIgG1Fc一起裝入真核表達(dá)載體pcDNA3中，酶切測序鑒定，證實得到了ICOS的可溶性表達(dá)重組載體。 2. 人ICOSIg融合蛋白的表達(dá)，純化和鑒定。 ⑴脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染COS-7；夾心ELISA法證實培養(yǎng)上清中有融合蛋白的表達(dá)。 ⑵蛋白A親和層析法純化融合蛋白ICOSIg，用SDS-PAGE、夾心ELISA、Western Blot鑒定融合蛋白的表達(dá)。 ⑶利用混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)證實ICOSIg在體外具有抑制T細(xì)胞增殖、降低IL-10分泌功能，表明ICOSIg具有阻斷ICOS途徑的生物活性。為進(jìn)一步的功能研究或應(yīng)用打下基礎(chǔ)。 3. ICOSIg的蛋白質(zhì)分子特性和結(jié)構(gòu)功能關(guān)系的生物信息學(xué)分析 ⑴利用生物信息學(xué)手段預(yù)測CD28家族各成員膜外區(qū)和IgV結(jié)構(gòu)域序列，分析ICOSIg的蛋白質(zhì)分子特性。 ⑵在此基礎(chǔ)上，通過同源模建手段，獲得了ICOS和ICOSIg的三維空間結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)FDPPPF和TKGSGN基序可能是ICOSIg的功能位點，后者未見報道。為改造ICOS的結(jié)構(gòu)功能，獲得新的ICOS突變體提供線索。
【學(xué)位單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2003
【中圖分類】：R392
【部分圖文】：

體積 99μl↓℃ 2min，暫停，加入 Taq DNA 聚合酶 1μl( 5U)↓Touchdown PCR℃ 30sec，65℃→50℃ 30sec，72℃ l min； 15 個循環(huán)，每個循環(huán)降 1后退火溫度從 65℃降到 50℃�！� 30sec，55℃ 30sec，72℃ l min； 30 個循環(huán)↓ 10min 4μl PCR 產(chǎn)物于 1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。、人 ICOS 真核表達(dá)載體的構(gòu)建構(gòu)建策略

第三軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文篩選、鑒定板上的若干單個菌落，接種于 5m200rpm 振搖培養(yǎng)過夜，以 OmegaⅠ、SalⅠ酶切鑒定，初步判定陽性接，系定向克隆，無需鑒定陽性重實驗結(jié)果DNA 的 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物電泳鑒定：期相符，特異性高，未見明顯的引1 2 3

圖 1-2 人 ICOS-pCI-neo 的酶切鑒定fication of recombinated hICOS-pCI-neo plaCI-neo 的序列測定結(jié)果( 見圖 1-P-036224)比對，開放閱讀框完整公布序列相同。表明我們已經(jīng)將人載體上，為下一步工作打下基礎(chǔ)
【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：2892897