輪狀病毒Rotateq及Rotarix疫苗VP8~*蛋白的原核表達(dá)、純化與鑒定
發(fā)布時(shí)間：2020-12-26 11:53
目的 :通過大腸埃希菌原核表達(dá)體系,分別獲得輪狀病毒疫苗Rotateq及Rotarix的VP8*基因表達(dá)產(chǎn)物,為深入研究輪狀病毒VP8*蛋白的結(jié)構(gòu)和功能奠定基礎(chǔ)。方法 :基因合成輪狀病毒疫苗Rotateq及Rotarix的P[8]型VP8*基因序列,將其克隆到攜帶有GST標(biāo)簽的pGEX-4T1表達(dá)載體中構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEX-4T1-VP8*,測序正確后轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）,通過SDS-PAGE電泳檢測表達(dá)產(chǎn)物,并通過Glutathione Sepharose 4B純化柱進(jìn)行純化,Western Blot鑒定。結(jié)果 :SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示分子量52KD處有深染帶,Western-Blot顯示該處蛋白能與GST標(biāo)簽抗體結(jié)合。結(jié)論 :成功構(gòu)建了包含Rotateq及Rotarix VP8*基因的重組表達(dá)載體pGEX-4T1-VP8*,獲得了可溶性GST-VP8*重組蛋白。
【文章來源】：湖南師范大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版). 2019年03期
【文章頁數(shù)】：4 頁
【部分圖文】：
AVP8*基因的PCR擴(kuò)增（1和2分別為RotaTeq和RotarixVP8*基因）
-6-學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2019，16（3）JHunanNormalUniv(MedSci)RotarixVP8*基因?yàn)槟０澹陨鲜龇謩e攜帶BamHI和XhoI限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的vp8*-F與vp8*-R為上下游引物進(jìn)行PCR循環(huán)，得到約為693bp的片段（圖1A）。重組質(zhì)粒pGEX-4T1-VP8*用BamHI和XhoI進(jìn)行雙酶切鑒定，酶切產(chǎn)物電泳后顯示的條帶與VP8*基因及載體pGEX-4T-1的大小相符（圖1B）。測序結(jié)果表明RotaTeq及RotarixVP8*基因重組表達(dá)質(zhì)粒均構(gòu)建成功。圖1AVP8*基因的PCR擴(kuò)增（1和2分別為RotaTeq和RotarixVP8*基因）圖1B重組質(zhì)粒的酶切鑒定（1和2分別為RotaTeq和RotarixVP8*-pGEX-4T-1重組質(zhì)粒的酶切結(jié)果）2.2重組質(zhì)粒在大腸桿菌BL21的誘導(dǎo)表達(dá)將重組質(zhì)粒pGEX-4T1-VP8*轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，在搖床上20℃誘導(dǎo)表達(dá)過夜。SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示，與未誘導(dǎo)全菌液相比，IPTG誘導(dǎo)后，上清液中出現(xiàn)了特異性條帶（52KD），重組質(zhì)粒得到可溶性表達(dá)（圖2）。2.3重組蛋白的純化在冰浴條件下超聲破碎菌體后收集上清液，用濾過器過濾后經(jīng)GlutathioneSepharose4B柱純化，以PBS緩沖液充分洗去雜蛋白，最后用還原性谷胱甘肽洗脫目的蛋白，SDS-PAGE電泳顯示，GST-vp8*融合蛋白大小約為52KD（圖3）。2.4重組蛋白western-blot鑒定將純化的蛋白進(jìn)行Westernblot鑒定，結(jié)果顯示，純化融合蛋白能被GST標(biāo)簽抗體識別并結(jié)合，52KD處可見一條明顯的蛋白印跡條帶，表明融合蛋白的確為GST-VP8*重組蛋白（圖4）。圖2重組質(zhì)粒pGEX-4T1-VP8*的誘導(dǎo)表達(dá)（2和4分別為RotaTeq和RotarixVP8*-pGEX-4T-1重組質(zhì)粒的表達(dá)）圖3重組蛋白的純化（1和2分別為RotaTeq和RotarixVP8*-GST重組蛋白）圖4重組蛋白的wester
52KD），重組質(zhì)粒得到可溶性表達(dá)（圖2）。2.3重組蛋白的純化在冰浴條件下超聲破碎菌體后收集上清液，用濾過器過濾后經(jīng)GlutathioneSepharose4B柱純化，以PBS緩沖液充分洗去雜蛋白，最后用還原性谷胱甘肽洗脫目的蛋白，SDS-PAGE電泳顯示，GST-vp8*融合蛋白大小約為52KD（圖3）。2.4重組蛋白western-blot鑒定將純化的蛋白進(jìn)行Westernblot鑒定，結(jié)果顯示，純化融合蛋白能被GST標(biāo)簽抗體識別并結(jié)合，52KD處可見一條明顯的蛋白印跡條帶，表明融合蛋白的確為GST-VP8*重組蛋白（圖4）。圖2重組質(zhì)粒pGEX-4T1-VP8*的誘導(dǎo)表達(dá)（2和4分別為RotaTeq和RotarixVP8*-pGEX-4T-1重組質(zhì)粒的表達(dá)）圖3重組蛋白的純化（1和2分別為RotaTeq和RotarixVP8*-GST重組蛋白）圖4重組蛋白的western-blot鑒定（1和2分別為RotaTeq和RotarixVP8*-GST重組蛋白）3討論輪狀病毒是一種能經(jīng)過糞口途徑傳播，引起嬰幼兒重癥腹瀉的主要病原體之一，給世界各國，尤其是發(fā)展中國家?guī)砹藝?yán)重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，是世界范圍的嚴(yán)重公共衛(wèi)生問題［11］。針對輪狀病毒感染，目前尚未研究出特效治療藥物，疫苗接種可以減少RVs腹瀉、降低RVs致死率，2009年，WHO提出將輪狀病毒疫苗納入計(jì)劃免
【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]確認(rèn)我國輪狀病毒疫苗株LLR基因型為G10P[15][J]. 李丹地,徐子乾,謝廣成,劉娜,王宏,章青,孫曉曼,郭妮君,龐立麗,段招軍. 病毒學(xué)報(bào). 2015(02)
本文編號：2939647
【文章來源】：湖南師范大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版). 2019年03期
【文章頁數(shù)】：4 頁
【部分圖文】：
AVP8*基因的PCR擴(kuò)增（1和2分別為RotaTeq和RotarixVP8*基因）
-6-學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2019，16（3）JHunanNormalUniv(MedSci)RotarixVP8*基因?yàn)槟０澹陨鲜龇謩e攜帶BamHI和XhoI限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的vp8*-F與vp8*-R為上下游引物進(jìn)行PCR循環(huán)，得到約為693bp的片段（圖1A）。重組質(zhì)粒pGEX-4T1-VP8*用BamHI和XhoI進(jìn)行雙酶切鑒定，酶切產(chǎn)物電泳后顯示的條帶與VP8*基因及載體pGEX-4T-1的大小相符（圖1B）。測序結(jié)果表明RotaTeq及RotarixVP8*基因重組表達(dá)質(zhì)粒均構(gòu)建成功。圖1AVP8*基因的PCR擴(kuò)增（1和2分別為RotaTeq和RotarixVP8*基因）圖1B重組質(zhì)粒的酶切鑒定（1和2分別為RotaTeq和RotarixVP8*-pGEX-4T-1重組質(zhì)粒的酶切結(jié)果）2.2重組質(zhì)粒在大腸桿菌BL21的誘導(dǎo)表達(dá)將重組質(zhì)粒pGEX-4T1-VP8*轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，在搖床上20℃誘導(dǎo)表達(dá)過夜。SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示，與未誘導(dǎo)全菌液相比，IPTG誘導(dǎo)后，上清液中出現(xiàn)了特異性條帶（52KD），重組質(zhì)粒得到可溶性表達(dá)（圖2）。2.3重組蛋白的純化在冰浴條件下超聲破碎菌體后收集上清液，用濾過器過濾后經(jīng)GlutathioneSepharose4B柱純化，以PBS緩沖液充分洗去雜蛋白，最后用還原性谷胱甘肽洗脫目的蛋白，SDS-PAGE電泳顯示，GST-vp8*融合蛋白大小約為52KD（圖3）。2.4重組蛋白western-blot鑒定將純化的蛋白進(jìn)行Westernblot鑒定，結(jié)果顯示，純化融合蛋白能被GST標(biāo)簽抗體識別并結(jié)合，52KD處可見一條明顯的蛋白印跡條帶，表明融合蛋白的確為GST-VP8*重組蛋白（圖4）。圖2重組質(zhì)粒pGEX-4T1-VP8*的誘導(dǎo)表達(dá)（2和4分別為RotaTeq和RotarixVP8*-pGEX-4T-1重組質(zhì)粒的表達(dá)）圖3重組蛋白的純化（1和2分別為RotaTeq和RotarixVP8*-GST重組蛋白）圖4重組蛋白的wester
52KD），重組質(zhì)粒得到可溶性表達(dá)（圖2）。2.3重組蛋白的純化在冰浴條件下超聲破碎菌體后收集上清液，用濾過器過濾后經(jīng)GlutathioneSepharose4B柱純化，以PBS緩沖液充分洗去雜蛋白，最后用還原性谷胱甘肽洗脫目的蛋白，SDS-PAGE電泳顯示，GST-vp8*融合蛋白大小約為52KD（圖3）。2.4重組蛋白western-blot鑒定將純化的蛋白進(jìn)行Westernblot鑒定，結(jié)果顯示，純化融合蛋白能被GST標(biāo)簽抗體識別并結(jié)合，52KD處可見一條明顯的蛋白印跡條帶，表明融合蛋白的確為GST-VP8*重組蛋白（圖4）。圖2重組質(zhì)粒pGEX-4T1-VP8*的誘導(dǎo)表達(dá)（2和4分別為RotaTeq和RotarixVP8*-pGEX-4T-1重組質(zhì)粒的表達(dá)）圖3重組蛋白的純化（1和2分別為RotaTeq和RotarixVP8*-GST重組蛋白）圖4重組蛋白的western-blot鑒定（1和2分別為RotaTeq和RotarixVP8*-GST重組蛋白）3討論輪狀病毒是一種能經(jīng)過糞口途徑傳播，引起嬰幼兒重癥腹瀉的主要病原體之一，給世界各國，尤其是發(fā)展中國家?guī)砹藝?yán)重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，是世界范圍的嚴(yán)重公共衛(wèi)生問題［11］。針對輪狀病毒感染，目前尚未研究出特效治療藥物，疫苗接種可以減少RVs腹瀉、降低RVs致死率，2009年，WHO提出將輪狀病毒疫苗納入計(jì)劃免
【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]確認(rèn)我國輪狀病毒疫苗株LLR基因型為G10P[15][J]. 李丹地,徐子乾,謝廣成,劉娜,王宏,章青,孫曉曼,郭妮君,龐立麗,段招軍. 病毒學(xué)報(bào). 2015(02)
本文編號：2939647
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