發(fā)布時間：2018-03-08 23:01

  本文選題：INHα基因　切入點：RNAi　出處：《華中農(nóng)業(yè)大學》2015年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：水牛是我國南方重要的地方品種,具有較強抗病及耐粗飼特性;水牛奶比荷斯坦奶牛的牛奶具有更高的蛋白率和乳脂率,在肉用和乳用等方面均具有很大的潛力,然而,水牛較低的繁殖性能制約著水牛業(yè)的發(fā)展。抑制素(Inhibin,INH)是重要的生殖激素,通過負反饋調(diào)節(jié)抑制促卵泡素(FSH,Follicle-stimulating hormone)的合成與分泌來抑制卵巢的發(fā)育和卵泡的成熟以及精子的發(fā)生與成熟,目前已經(jīng)開展了通過研制INH單基因疫苗免疫提高豬、小鼠等動物繁殖力的研究。為了通過持續(xù)干擾INHα基因來改善水牛的繁殖性能,本研究利用顯微受精技術(shù)和轉(zhuǎn)基因技術(shù)將水牛INHα基因RNAi片段(B和C)和小鼠INHα基因RNAi片段(M和C,其中片段C為針對水牛和小鼠中相同CDs序列設(shè)計的)分別整合到小鼠基因組中(公司協(xié)助),以該三個不同RNAi片段轉(zhuǎn)基因陽性小鼠為研究材料,比較分析INHα基因三個不同RNAi片段的干擾作用及其效果,為研究INHα基因功能以及其在提高繁殖性能打下基礎(chǔ)。本實驗主要的結(jié)果如下:1、INHα基因的三個不同RNAi片段的干擾作用及其效率的研究(1)INHα基因的RNAi片段干擾效率的分析:在F3代3周齡轉(zhuǎn)基因雌鼠中,采用PCR技術(shù)檢測其陽性;然后,利用QPCR技術(shù)分析該轉(zhuǎn)基因陽性雌鼠的三個干擾片段的干擾效率,其干擾效率為C(96.1%)M(75.1%)B(27.5%),可能是由于C片段是根據(jù)水牛和小鼠INHα基因共同CDs序列設(shè)計的且與干擾轉(zhuǎn)錄靶位點有關(guān);(2)INHα基因的RNAi片段陽性率的分析:提取F3代個體基因組DNA,用PCR分析后代轉(zhuǎn)基因子鼠陽性比率,B、C和M片段在F3代中陽性率依次為81.3%、51.1%和77.6%,即陽性率BMC;(3)INHα基因的RNAi片段對產(chǎn)仔性能作用的分析:統(tǒng)計和分析三個不同干擾片段轉(zhuǎn)基因陽性小鼠連續(xù)三代第一胎產(chǎn)仔數(shù),與野生小鼠相比,轉(zhuǎn)基因小鼠后代的產(chǎn)仔數(shù)略有增加,B和M片段在F1、F2代第一胎產(chǎn)仔數(shù)有所增加,但沒有顯著差異(P0.05)。此外,比較三個不同干擾片段轉(zhuǎn)基因陽性小鼠不同胎次產(chǎn)仔數(shù),發(fā)現(xiàn)產(chǎn)仔數(shù)隨胎次的增加有所下降,且低于野生型小鼠;(4)INHα基因的RNAi片段對生殖激素、生殖腺重量影響的分析:ELISA方法檢測F3代轉(zhuǎn)基因小鼠血液中FSH、雌激素和雄激素的水平,結(jié)果表明這三種激素水平均有所上升。與野生型小鼠相比,3周齡F3代轉(zhuǎn)基因小鼠的睪丸、卵巢及出生均重均顯著增加(P0.05);2、攜帶B干擾片段轉(zhuǎn)基因小鼠不同交配方式轉(zhuǎn)基因后代干擾效果的比較分析:根據(jù)試驗結(jié)果,選擇遺傳穩(wěn)定性較好、繁殖性能略高和生殖器官略重、根據(jù)水牛INHα基因序列設(shè)計的B干擾片段轉(zhuǎn)基因小鼠,進行不同交配方式配種(B×B、B×WT,以野生型WT×WT為對照)。(5)INHα基因的RNAi片段不同配種方式對INHα基因干擾效率影響分析:B×WT型小鼠的干擾效率低于攜帶B×B純合小鼠后代,但干擾效率均達到70%以上,此外該雜交后代其陽性比率高于純合后代;(6)INHα基因的RNAi片段不同配種方式對小鼠成活、血液免疫相關(guān)指標影響的分析:轉(zhuǎn)基因小鼠(B×B、B×WT)存活率高于野生型;血常規(guī)分析顯示單核細胞數(shù)MO減少,淋巴細胞數(shù)LY增多,而紅細胞數(shù)RBC顯著增加(P0.05);(7)INHα基因的RNAi片段不同配種方式對睪丸支持細胞凋亡影響的分析:利用流式細胞儀檢測技術(shù)分析了睪丸支持細胞的凋亡水平,轉(zhuǎn)基因小鼠(B×B)睪丸支持細胞凋亡率(5.4%)顯著高于野生型小鼠(1.46%)。QPCR檢測相關(guān)凋亡因子P53和Bcl2,結(jié)果顯示這兩者m RNA水平均顯著下調(diào),但抗凋亡因子Bcl2表達水平下降的程度比促凋亡因子P53更高;(8)INHα基因的RNAi片段不同配種方式對支持細胞相關(guān)基因表達影響的分析:支持細胞上骨橋蛋白OPN(Osteopontin)在轉(zhuǎn)基因小鼠(B×B、B×WT)體內(nèi)表達顯著上升(P0.05)、FSH受體基因FSHR表達下降;細胞熒光實驗表明二者均定位于支持細胞SC的細胞膜上,二者是否存在互作以及其功能還需進一步研究;(9)IHNα基因干擾效率在20-70%范圍內(nèi),可能有利于后代繁殖性狀的提高;在70-80%范圍內(nèi),可能對繁殖性能的影響不大;干擾效率超過80%可能會導致腫瘤的發(fā)生,不利于繁殖性能的提高。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S814.1

【引證文獻】

相關(guān)會議論文 前1條

1 李德如;覃廣勝;覃永長;葦英明;黃群山;蔣和生;施振旦;;主動免疫抑制素對水牛卵泡發(fā)育、超排反應(yīng)和相關(guān)激素分泌的影響研究[A];中國畜牧獸醫(yī)學會動物繁殖學分會第十五屆學術(shù)研討會論文集（下冊）[C];2010年

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本文編號：1585900