隨著經濟水平的提高,生產和生活中對于肉類食品需求大大提高,而且隨著運輸條件,保存條件以及肉類價格上調的影響,越來越多的目光聚焦于如何提高肉類產量與質量上面。因此,如何提升肉畜的品質成為當務之急,而其中的關鍵之一便是如何提高優(yōu)秀種畜的利用率。隨后,人工授精技術應運而生,人工授精技術是指在種畜與受體母畜之間沒有直接的配種技術,而經過人工獲取精液而進一步注入母畜體內,幫助母畜受孕的過程。精液保存技術作為人工授精技術的核心技術之一,最開始是采用稀釋液而存在,這樣能夠將種豬一次射出的精液用于多只母畜受孕。隨后,研究人員發(fā)現稀釋液的成分很大程度上影響著母畜受孕率以及產仔數。因而,世界各地掀起了一場稀釋液成分研究的熱潮。研究人員主要著手的方面在于保存液的能源物質,滲透壓以及其他修飾成分,這些成分包括抗氧化劑,螯合劑以及質膜保護劑。剛剛射出的豬精液pH值在7.2到7.5之間。當保存液中存在葡萄糖的情況下,保存液pH值能夠在20小時之內迅速降低到6.2左右。盡管研究人員普遍認為低pH值能夠降低精子運動能力與代謝水平從而有利于維持保存和操作過程中精子活力,但是代謝過程中產生的酸會導致精子酸中毒從而不利于精液長期保存。因而適當的在保存液中添加緩沖物質是必要的。前期研究證實了精液保存過程中保存液的初始pH值對于維持操作或者保存過程中精子活力非常重要。但是對于保存過程中pH值的變化還沒有詳細報道,因而定期檢測保存液pH值,建立一個pH值隨時間變化的非線性模型對于優(yōu)化豬精液長期液態(tài)保存具有非常重要的意義。本試驗通過使用Androhep做為基礎保存液,首先證實了初始pH值在6.4～6.5之間對于精液保存有最好的保存效果,隨后建立精子活力-pH值隨時間變化非線性模型,進一步驗證了pH值與精子活力變化之間的關系,通過數據分析二者相關系數r=0.954相關性顯著,隨后通過換液方式穩(wěn)定pH值,發(fā)現換液方式能夠有效地提高精子活力顯著提高精液保存時間,因而根據緩沖范圍我們采用了一種最近興起的緩沖物質2-嗎啉乙磺酸(MES)。MES的最佳緩沖范圍為5.7～6.7之間,具有緩沖容量大,緩沖范圍廣且無生物毒性的優(yōu)點。改良型緩沖液稱為Andromes,在保存過程中Andromes能夠顯著提高精子活力延長保存時間。我們還比較了三種不同的緩沖物質對豬精液液態(tài)保存的影響,還檢測了與精子質量有重要關系的精子運動參數、質膜完整率、頂體完整率和線粒體活性。結果證實:(1)精液保存過程中精子活力的降低與pH值降低具有密切關系。(2)豬精液最佳保存初始pH值在6.40～6.50之間,當pH值過高或者過低時都導致精子活力下降,不利于精液保存。(3)Androphep、Androptris相比Andromes保存液能夠提高豬精液保存效果。(4)穩(wěn)定pH值能夠有效地提高精子保存效果和體外受精能力。

 

 

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【學位級別】：碩士

【部分圖文：】

引言精漿混合，形成精液。精液中精漿為堿性，精子混合后精子從弱酸性條件下謝能力與運動能力[76]。但是在長期保存過程中精子代謝葡萄糖產生以乳酸物，過多的酸性代謝產物能夠導致精子在保存過程中代謝降低甚至酸中毒液中添加緩沖物質對于維持精液保存過程中維持精子活力非常重要[77]。目的緩沖物質包含檸檬酸鈉，磷酸二氫鉀，磷酸二氫鈉，酒石酸鉀鈉。目前三羥基氨基甲烷（Tris）添加到保存液中，Tris 是一種堿性緩沖劑，對于精毒和酸中毒具有非常有效的緩沖作用[]。保存液中添加的緩沖劑通常都是兩檬酸鈉，HEPES，三羥基氨基甲烷，NaHCO3，酒石酸鉀鈉，磷酸二酸鈉合使用更能夠有效地提高保存液的緩沖效果。實驗室常用緩沖物液成分及，圖 1-1。

子活力檢測溫度從 30℃降到設定溫度后的檢測值記為第 0 天的檢測值，保存 24 h 的記為存天數以此類推。檢測時把保存稀釋液混勻取出 1 mL 放入 37℃恒溫培養(yǎng)箱中使用清華同方精子活力檢測系統（MX7.5）檢測精子活力和活率。檢精子數不子。檢測方法是，將精液保存液放入培養(yǎng)箱孵育 20 到 30 分鐘后，輕輕混勻，用輕吸取中層精液 5μl，放入預熱好的精子計數池之中，蓋好蓋玻片，將精子計鏡物鏡下，調好焦距，運行精子活力檢測系統，檢查原始參數是否與預設值相視野數：6；采樣間隔幀：1 毫秒；最大面積：80 微米；最小面積 15 微米；精5 微米/秒；精子最大速度：150 微米/秒；圖像閾值修正：30；圖像比例尺：32不小于 200 個。A 級：25 微米/秒，B 級：15 微米/秒，C 級：5 微米/秒，D密度修正系數：2.3239），運行系統開始檢測，采集 6 個視野至少 200 個精動狀態(tài)進行分析，剔除雜質以及分析準確度不高的精子，保存并打印結果。根織的標準，精子運動能力分為四種，分別為 a：快速向前進行直線運動的精子運動的精子；c：運動路線不正確或者原地抖動的精子；d：不運動精子。其中比例為 a+b，精子存活數量比例為 a+b+c。見圖 2-1。

PBS 鹽溶液中，小心迅速混合 5 到 8 下。（2）使用畢后去除上清，下層沉淀物加入 1 mL 多聚甲醛溶液重0 g 離心 5 min，去除上清后，下層沉淀物使用 PBS 重懸獲得的液體平鋪在載玻片上，室溫下干燥。（7）min，使用蒸餾水清洗掉多余染劑。（8）室溫下干燥整性檢測用低滲腫脹試驗檢測。在像 1000 毫升三蒸水中加入，檢測滲透壓約為 100 Osm 無誤后，將低滲液裝入藍取與精液保存溫度相等的低滲液 230μL 于 EP 管中，放入 37.5℃溫箱中孵育 30 到 40 分鐘。孵育完成后液，充分混合后取出 5μL，涂在血球計數板上，相差有實驗均重復 3 次或者 3 次以上。從精液溫度降到 17一天，進行一次 pH 值測定以及活力檢測。每次每組

 

文章目錄

 

摘要

英文摘要

1 引言

    1.1 人工授精技術的發(fā)展

    1.2 精液液態(tài)保存技術的發(fā)展與應用

    1.3 影響精液體外保存效果的因素

        1.3.1 冷休克

        1.3.2 稀釋的影響

        1.3.3 保存液成分

        1.3.4 保存時間

        1.3.5 精子生理狀態(tài)

    1.4 保存液pH值對精子活力影響

    1.5 精液保存過程中緩沖物質作用

    1.6 精子質量檢測

        1.6.1 精子的運動能力

        1.6.2 熒光顯微技術檢測精子質量

        1.6.3 精子受精和發(fā)育能力檢測

    1.7 研究目的與意義

2 材料與方法

    2.1 實驗動物

    2.2 主要試劑

    2.3 主要儀器

    2.4 主要溶液配制

    2.5 精液采集

    2.6 精液的稀釋與分裝

    2.7 精液的降溫與保存

    2.8 保存液pH值檢測

    2.9 精子質量檢測

        2.9.1 精子活力檢測

        2.9.2 精子頂體完整性檢測

        2.9.3 精子質膜完整性檢測

        2.9.4 線粒體膜電位檢測

        2.9.5 體外受精

    2.10 實驗設計

        2.10.1 精液保存最佳初始pH值確認

        2.10.2 保存過程中pH值與精子活力的變化

        2.10.3 穩(wěn)定保存液pH值

        2.10.4 稀釋液緩沖系統的優(yōu)化

    2.11 統計分析

3 結果與分析

    3.1 液態(tài)保存最佳pH值的確定

    3.2 pH值與精子活力的關系

    3.3 換半液穩(wěn)定pH值對精子活力的影響

    3.4 調節(jié)pH值對精子活力的影響

    3.5 稀釋液緩沖系統的優(yōu)化

    3.6 穩(wěn)定pH值精子對質膜完整性影響

    3.7 穩(wěn)定pH值對精子頂體完整性影響

    3.8 穩(wěn)定pH值對精子線粒體膜電位的影響

    3.9 穩(wěn)定pH值對精子體外受精能力的影響

4 討論

    4.1 不同初始pH值的精液保存液保存時間與精子活力之間的關系

    4.2 換半液與調節(jié)pH對精子活力的影響

    4.3 改進稀釋液緩沖系統對精液保存效果的影響

    4.4 穩(wěn)定pH值對精液保存效果的影響

    4.5 穩(wěn)定pH值對精子質膜完整性和頂體完整性的影響

    4.6 pH值影響線粒體功能的原因

    4.7 穩(wěn)定保存液的pH與保存精子受精的能力

5 結論

致謝

參考文獻

攻讀碩士學位期間發(fā)表的學術論文