隨著經(jīng)濟(jì)水平的提高,生產(chǎn)和生活中對(duì)于肉類食品需求大大提高,而且隨著運(yùn)輸條件,保存條件以及肉類價(jià)格上調(diào)的影響,越來(lái)越多的目光聚焦于如何提高肉類產(chǎn)量與質(zhì)量上面。因此,如何提升肉畜的品質(zhì)成為當(dāng)務(wù)之急,而其中的關(guān)鍵之一便是如何提高優(yōu)秀種畜的利用率。隨后,人工授精技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生,人工授精技術(shù)是指在種畜與受體母畜之間沒(méi)有直接的配種技術(shù),而經(jīng)過(guò)人工獲取精液而進(jìn)一步注入母畜體內(nèi),幫助母畜受孕的過(guò)程。精液保存技術(shù)作為人工授精技術(shù)的核心技術(shù)之一,最開始是采用稀釋液而存在,這樣能夠?qū)⒎N豬一次射出的精液用于多只母畜受孕。隨后,研究人員發(fā)現(xiàn)稀釋液的成分很大程度上影響著母畜受孕率以及產(chǎn)仔數(shù)。因而,世界各地掀起了一場(chǎng)稀釋液成分研究的熱潮。研究人員主要著手的方面在于保存液的能源物質(zhì),滲透壓以及其他修飾成分,這些成分包括抗氧化劑,螯合劑以及質(zhì)膜保護(hù)劑。剛剛射出的豬精液pH值在7.2到7.5之間。當(dāng)保存液中存在葡萄糖的情況下,保存液pH值能夠在20小時(shí)之內(nèi)迅速降低到6.2左右。盡管研究人員普遍認(rèn)為低pH值能夠降低精子運(yùn)動(dòng)能力與代謝水平從而有利于維持保存和操作過(guò)程中精子活力,但是代謝過(guò)程中產(chǎn)生的酸會(huì)導(dǎo)致精子酸中毒從而不利于精液長(zhǎng)期保存。因而適當(dāng)?shù)脑诒４嬉褐刑砑泳彌_物質(zhì)是必要的。前期研究證實(shí)了精液保存過(guò)程中保存液的初始pH值對(duì)于維持操作或者保存過(guò)程中精子活力非常重要。但是對(duì)于保存過(guò)程中pH值的變化還沒(méi)有詳細(xì)報(bào)道,因而定期檢測(cè)保存液pH值,建立一個(gè)pH值隨時(shí)間變化的非線性模型對(duì)于優(yōu)化豬精液長(zhǎng)期液態(tài)保存具有非常重要的意義。本試驗(yàn)通過(guò)使用Androhep做為基礎(chǔ)保存液,首先證實(shí)了初始pH值在6.4～6.5之間對(duì)于精液保存有最好的保存效果,隨后建立精子活力-pH值隨時(shí)間變化非線性模型,進(jìn)一步驗(yàn)證了pH值與精子活力變化之間的關(guān)系,通過(guò)數(shù)據(jù)分析二者相關(guān)系數(shù)r=0.954相關(guān)性顯著,隨后通過(guò)換液方式穩(wěn)定pH值,發(fā)現(xiàn)換液方式能夠有效地提高精子活力顯著提高精液保存時(shí)間,因而根據(jù)緩沖范圍我們采用了一種最近興起的緩沖物質(zhì)2-嗎啉乙磺酸(MES)。MES的最佳緩沖范圍為5.7～6.7之間,具有緩沖容量大,緩沖范圍廣且無(wú)生物毒性的優(yōu)點(diǎn)。改良型緩沖液稱為Andromes,在保存過(guò)程中Andromes能夠顯著提高精子活力延長(zhǎng)保存時(shí)間。我們還比較了三種不同的緩沖物質(zhì)對(duì)豬精液液態(tài)保存的影響,還檢測(cè)了與精子質(zhì)量有重要關(guān)系的精子運(yùn)動(dòng)參數(shù)、質(zhì)膜完整率、頂體完整率和線粒體活性。結(jié)果證實(shí):(1)精液保存過(guò)程中精子活力的降低與pH值降低具有密切關(guān)系。(2)豬精液最佳保存初始pH值在6.40～6.50之間,當(dāng)pH值過(guò)高或者過(guò)低時(shí)都導(dǎo)致精子活力下降,不利于精液保存。(3)Androphep、Androptris相比Andromes保存液能夠提高豬精液保存效果。(4)穩(wěn)定pH值能夠有效地提高精子保存效果和體外受精能力。

 

 

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【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文：】

引言精漿混合，形成精液。精液中精漿為堿性，精子混合后精子從弱酸性條件下謝能力與運(yùn)動(dòng)能力[76]。但是在長(zhǎng)期保存過(guò)程中精子代謝葡萄糖產(chǎn)生以乳酸物，過(guò)多的酸性代謝產(chǎn)物能夠?qū)е戮釉诒４孢^(guò)程中代謝降低甚至酸中毒液中添加緩沖物質(zhì)對(duì)于維持精液保存過(guò)程中維持精子活力非常重要[77]。目的緩沖物質(zhì)包含檸檬酸鈉，磷酸二氫鉀，磷酸二氫鈉，酒石酸鉀鈉。目前三羥基氨基甲烷（Tris）添加到保存液中，Tris 是一種堿性緩沖劑，對(duì)于精毒和酸中毒具有非常有效的緩沖作用[]。保存液中添加的緩沖劑通常都是兩檬酸鈉，HEPES，三羥基氨基甲烷，NaHCO3，酒石酸鉀鈉，磷酸二酸鈉合使用更能夠有效地提高保存液的緩沖效果。實(shí)驗(yàn)室常用緩沖物液成分及，圖 1-1。

子活力檢測(cè)溫度從 30℃降到設(shè)定溫度后的檢測(cè)值記為第 0 天的檢測(cè)值，保存 24 h 的記為存天數(shù)以此類推。檢測(cè)時(shí)把保存稀釋液混勻取出 1 mL 放入 37℃恒溫培養(yǎng)箱中使用清華同方精子活力檢測(cè)系統(tǒng)（MX7.5）檢測(cè)精子活力和活率。檢精子數(shù)不子。檢測(cè)方法是，將精液保存液放入培養(yǎng)箱孵育 20 到 30 分鐘后，輕輕混勻，用輕吸取中層精液 5μl，放入預(yù)熱好的精子計(jì)數(shù)池之中，蓋好蓋玻片，將精子計(jì)鏡物鏡下，調(diào)好焦距，運(yùn)行精子活力檢測(cè)系統(tǒng)，檢查原始參數(shù)是否與預(yù)設(shè)值相視野數(shù)：6；采樣間隔幀：1 毫秒；最大面積：80 微米；最小面積 15 微米；精5 微米/秒；精子最大速度：150 微米/秒；圖像閾值修正：30；圖像比例尺：32不小于 200 個(gè)。A 級(jí)：25 微米/秒，B 級(jí)：15 微米/秒，C 級(jí)：5 微米/秒，D密度修正系數(shù)：2.3239），運(yùn)行系統(tǒng)開始檢測(cè)，采集 6 個(gè)視野至少 200 個(gè)精動(dòng)狀態(tài)進(jìn)行分析，剔除雜質(zhì)以及分析準(zhǔn)確度不高的精子，保存并打印結(jié)果。根織的標(biāo)準(zhǔn)，精子運(yùn)動(dòng)能力分為四種，分別為 a：快速向前進(jìn)行直線運(yùn)動(dòng)的精子運(yùn)動(dòng)的精子；c：運(yùn)動(dòng)路線不正確或者原地抖動(dòng)的精子；d：不運(yùn)動(dòng)精子。其中比例為 a+b，精子存活數(shù)量比例為 a+b+c。見圖 2-1。

PBS 鹽溶液中，小心迅速混合 5 到 8 下。（2）使用畢后去除上清，下層沉淀物加入 1 mL 多聚甲醛溶液重0 g 離心 5 min，去除上清后，下層沉淀物使用 PBS 重懸獲得的液體平鋪在載玻片上，室溫下干燥。（7）min，使用蒸餾水清洗掉多余染劑。（8）室溫下干燥整性檢測(cè)用低滲腫脹試驗(yàn)檢測(cè)。在像 1000 毫升三蒸水中加入，檢測(cè)滲透壓約為 100 Osm 無(wú)誤后，將低滲液裝入藍(lán)取與精液保存溫度相等的低滲液 230μL 于 EP 管中，放入 37.5℃溫箱中孵育 30 到 40 分鐘。孵育完成后液，充分混合后取出 5μL，涂在血球計(jì)數(shù)板上，相差有實(shí)驗(yàn)均重復(fù) 3 次或者 3 次以上。從精液溫度降到 17一天，進(jìn)行一次 pH 值測(cè)定以及活力檢測(cè)。每次每組

 

文章目錄

 

摘要

英文摘要

1 引言

    1.1 人工授精技術(shù)的發(fā)展

    1.2 精液液態(tài)保存技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用

    1.3 影響精液體外保存效果的因素

        1.3.1 冷休克

        1.3.2 稀釋的影響

        1.3.3 保存液成分

        1.3.4 保存時(shí)間

        1.3.5 精子生理狀態(tài)

    1.4 保存液pH值對(duì)精子活力影響

    1.5 精液保存過(guò)程中緩沖物質(zhì)作用

    1.6 精子質(zhì)量檢測(cè)

        1.6.1 精子的運(yùn)動(dòng)能力

        1.6.2 熒光顯微技術(shù)檢測(cè)精子質(zhì)量

        1.6.3 精子受精和發(fā)育能力檢測(cè)

    1.7 研究目的與意義

2 材料與方法

    2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

    2.2 主要試劑

    2.3 主要儀器

    2.4 主要溶液配制

    2.5 精液采集

    2.6 精液的稀釋與分裝

    2.7 精液的降溫與保存

    2.8 保存液pH值檢測(cè)

    2.9 精子質(zhì)量檢測(cè)

        2.9.1 精子活力檢測(cè)

        2.9.2 精子頂體完整性檢測(cè)

        2.9.3 精子質(zhì)膜完整性檢測(cè)

        2.9.4 線粒體膜電位檢測(cè)

        2.9.5 體外受精

    2.10 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

        2.10.1 精液保存最佳初始pH值確認(rèn)

        2.10.2 保存過(guò)程中pH值與精子活力的變化

        2.10.3 穩(wěn)定保存液pH值

        2.10.4 稀釋液緩沖系統(tǒng)的優(yōu)化

    2.11 統(tǒng)計(jì)分析

3 結(jié)果與分析

    3.1 液態(tài)保存最佳pH值的確定

    3.2 pH值與精子活力的關(guān)系

    3.3 換半液穩(wěn)定pH值對(duì)精子活力的影響

    3.4 調(diào)節(jié)pH值對(duì)精子活力的影響

    3.5 稀釋液緩沖系統(tǒng)的優(yōu)化

    3.6 穩(wěn)定pH值精子對(duì)質(zhì)膜完整性影響

    3.7 穩(wěn)定pH值對(duì)精子頂體完整性影響

    3.8 穩(wěn)定pH值對(duì)精子線粒體膜電位的影響

    3.9 穩(wěn)定pH值對(duì)精子體外受精能力的影響

4 討論

    4.1 不同初始pH值的精液保存液保存時(shí)間與精子活力之間的關(guān)系

    4.2 換半液與調(diào)節(jié)pH對(duì)精子活力的影響

    4.3 改進(jìn)稀釋液緩沖系統(tǒng)對(duì)精液保存效果的影響

    4.4 穩(wěn)定pH值對(duì)精液保存效果的影響

    4.5 穩(wěn)定pH值對(duì)精子質(zhì)膜完整性和頂體完整性的影響

    4.6 pH值影響線粒體功能的原因

    4.7 穩(wěn)定保存液的pH與保存精子受精的能力

5 結(jié)論

致謝

參考文獻(xiàn)

攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文