發(fā)布時間：2019-07-05 14:03

【摘要】：在畜牧養(yǎng)殖業(yè),用于預(yù)防和治療細(xì)菌感染疾病的傳統(tǒng)抗生素存在諸多弊端,研制新型安全的抗生素替代品已成當(dāng)務(wù)之急。豬源抗菌肽PR39是最早從豬體內(nèi)分離得到的抗菌肽,在體外實驗中具有較強的殺菌活性,并具有趨化、促進(jìn)損傷修復(fù)等多種免疫調(diào)節(jié)功能。前期研究表明,細(xì)菌感染時豬體內(nèi)抗菌肽PR39的表達(dá)顯著升高,提示PR39在豬的抗感染過程中可能發(fā)揮重要作用,但其具體發(fā)揮何種作用以及其作用機制還不得而知。因此,本研究從抗菌肽PR39調(diào)節(jié)動物腸道黏膜上皮屏障功能的角度出發(fā),開展了三個試驗：首先利用人工模擬豬胃腸液和血清研究了抗菌肽PR39在豬體內(nèi)的抗菌活性和穩(wěn)定性,并通過小鼠活體成像技術(shù)探究PR39經(jīng)腹腔注射后的分布與代謝情況；在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步利用感染機制不同的兩種常見致病菌感染的小鼠模型,系統(tǒng)地研究了抗菌肽PR39對細(xì)菌感染引起的腸道上皮屏障功能破壞的保護(hù)作用；最后利用Transwell培養(yǎng)的豬腸道上皮細(xì)胞模型,初步探究了抗菌肽PR39調(diào)節(jié)腸道黏膜上皮屏障功能的分子機制。主要研究結(jié)果如下：試驗一抗菌肽PR39在體內(nèi)的抗菌活性、穩(wěn)定性及分布研究為了探明抗菌肽PR39在體內(nèi)是否具有抗菌活性,首先利用人工胃液、小腸液和血清模擬體內(nèi)環(huán)境,研究了其在體內(nèi)的抗菌活性和穩(wěn)定性�？咕�活性結(jié)果表明,在MH肉湯培養(yǎng)基中抗菌活性較強的PR39,在人工胃液和小腸液環(huán)境下其抗菌活性完全喪失,而在血清中保留了一部分抗菌活性。穩(wěn)定性試驗結(jié)果表明,PR39與人工小腸液共同孵育5min即被快速降解為小肽,與人工胃液共同孵育1h內(nèi)也逐漸被降解完全,提示PR39在胃腸道環(huán)境下穩(wěn)定性極差,不宜直接口服。而PR39與血清共同孵育1h后,依然可檢測到約70%完整的PR39,其半衰期約為2 h,提示PR39在血清里具有較好的穩(wěn)定性,宜通過注射給藥。進(jìn)一步通過小鼠活體成像技術(shù),觀察抗菌肽PR39經(jīng)腹腔注射后在體內(nèi)的分布代謝情況,結(jié)果表明,PR39經(jīng)腹腔注射后可迅速被腹膜吸收而進(jìn)入機體循環(huán)系統(tǒng),30 min內(nèi)遍布全身,并在24h內(nèi)完全代謝出體外,提示抗菌肽PR39經(jīng)腹腔注射途徑可以進(jìn)入機體循環(huán)系統(tǒng)而發(fā)揮作用。試驗二抗菌肽PR39對小鼠抗細(xì)菌感染的作用研究(1)抗菌肽PR39對小鼠抗鼠傷寒沙門氏菌感染的作用研究通過建立鼠傷寒沙門氏菌感染小鼠模型,從表觀癥狀、炎癥反應(yīng)及腸道黏膜上皮屏障功能三個方面研究了PR39對小鼠抗沙門氏菌感染的作用：抗菌肽PR39對沙門氏菌感染小鼠表觀癥狀影響的結(jié)果表明,小鼠在感染鼠傷寒沙門氏菌后,出現(xiàn)食欲下降、體重下降及軟便等癥狀,而腹腔注射PR39可以明顯緩解上述癥狀,且小鼠腎臟和肝臟中細(xì)菌移位數(shù)量也顯著降低,說明腹腔注射PR39顯著緩解了小鼠的沙門氏菌感染癥狀；抗菌肽PR39對沙門氏曹感染小鼠炎癥反應(yīng)影響的結(jié)果表明,腹腔注射PR39的沙門氏菌感染小鼠其結(jié)腸組織的MPO濃度顯著低于沙門氏菌組(P0.05),但仍高于正常對照組(P0.05),表明PR39在一定程度上減少了沙門氏菌感染引起的小鼠結(jié)腸嗜中性粒細(xì)胞浸潤。但血清里炎性細(xì)胞因子含量及結(jié)腸中炎性細(xì)胞因子基因表達(dá)水平結(jié)果顯示,沙門氏菌組小鼠和腹腔注射PR39的沙門氏菌感染小鼠的促炎因子TNF-a、IL-8和抑炎因子IL-10的表達(dá)水平并無顯著差異,均顯著高于正常對照組(P0.05),提示PR39對炎性細(xì)胞因子的表達(dá)與分泌并無顯著影響；抗菌肽PR39對沙門氏菌感染小鼠腸道黏膜上皮屏障功能影響的結(jié)果表明,PR39顯著緩解了沙門氏菌感染造成的小鼠回腸絨毛高度變短、隱窩加深及絨毛／隱窩比下降,同時也顯著改善了結(jié)腸形態(tài)。利用尤斯灌流室測定結(jié)腸跨上皮電阻值(TER)和測定灌胃后血清中FITC-dextran含量兩種方法來評價各組小鼠的腸道通透性,結(jié)果表明,腹腔注射PR39可以顯著緩解沙門氏菌引起的小鼠腸道通透性升高,且單獨添加PR39可能增強了小鼠的腸道屏障功能。(2)抗菌肽PR39對小鼠抗腸出血性大腸桿菌感染的作用研究本試驗進(jìn)一步通過建立與鼠傷寒沙門氏菌作用機制完全不同的腸出血性大腸桿菌感染的小鼠模型,從表觀癥狀、腎臟及腸道組織形態(tài)和腸道黏膜上皮屏障功能三個方面研究了抗菌肽PR39對小鼠抗大腸桿菌感染的作用：抗菌肽PR39對大腸桿菌感染小鼠表觀癥狀影響的結(jié)果表明,小鼠在感染腸出血性大腸桿菌后,體重顯著下降,結(jié)腸組織MPO含量急劇升高,而腹腔注射PR39顯著緩解了上述癥狀,腎臟和肝臟中移位的細(xì)菌數(shù)量及概率也明顯降低；抗曹肽PR39對大腸桿菌感染小鼠腎臟及腸道組織形態(tài)影響的結(jié)果表明,PR39顯著緩解了腸出血性大腸桿菌感染導(dǎo)致的小鼠腎臟腎間質(zhì)血管和腎小球毛細(xì)血管充血、擴張等腎臟損傷,并且對小鼠回腸絨毛受損、黏膜下層充血,及結(jié)腸固有層水腫等形態(tài)破壞具有一定的改善作用。透射電鏡結(jié)果顯示,大腸桿菌感染后小鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞遭到大腸桿菌的粘附與破壞,其微絨毛明顯扭曲、變短和斷裂,上皮細(xì)胞間緊密連接打開,而腹腔注射PR39的大腸桿菌感染小鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞微絨毛排列整齊,形態(tài)正常,上皮細(xì)胞間緊密連接清晰。上述結(jié)果顯示PR39對大腸桿菌感染導(dǎo)致的腎臟及腸道組織形態(tài)受損具有一定的保護(hù)作用；抗菌肽PR39對大腸桿菌感染小鼠腸道黏膜上皮屏障功能影響的結(jié)果表明,相比于大腸桿菌組,腹腔注射PR39后小鼠結(jié)腸TER值顯著升高(P0.05),血清中FITC-dextran含量顯著降低(P0.05),表明腹腔注射PR39可以顯著緩解腸出血性大腸桿菌引起的腸道通透性升高。此外,PR39顯著緩解了大腸桿菌感染引起的小鼠結(jié)腸ZO-1和Occludin的基因表達(dá)水平下降,且PR39單獨處理組小鼠結(jié)腸Occludin的基因表達(dá)水平顯著高于正常對照組(P0.05)。各處理組之間ZO-2和Claudin-1的基因表達(dá)水平差異不明顯。試驗三抗菌肽PR39調(diào)控腸道屏障功能的作用機制研究(1)抗菌肽PR39對細(xì)菌感染豬腸道上皮細(xì)胞屏障功能的影響在上述結(jié)果的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步利用體外豬腸道上皮細(xì)胞(IPEC-1)細(xì)菌感染模型研究PR39對細(xì)菌感染后上皮細(xì)胞的緊密連接蛋白Occludin和細(xì)胞骨架蛋白F-actin的表達(dá)與分布、粘附與入侵細(xì)胞的細(xì)菌數(shù)量及上皮細(xì)胞通透性的影響。首先,不同濃度PR39作用于IPEC-1細(xì)胞后細(xì)胞的增值率和LDH釋放率的結(jié)果表明,PR39對IPEC-1細(xì)胞的毒性較小。免疫熒光試驗觀察各組上皮細(xì)胞的Occludin和F-actin的表達(dá)與分布結(jié)果表明,沙門氏菌或大腸桿菌分別刺激IPEC-1細(xì)胞4h后,細(xì)胞Occludin熒光值減弱并從細(xì)胞膜往細(xì)胞質(zhì)分布,F-actin排列紊亂,出現(xiàn)應(yīng)力纖維,而2 μg/mL PR39預(yù)處理明顯改善了沙門氏菌和大腸桿菌感染引起的豬腸道上皮細(xì)胞緊密連接蛋白Occludin的表達(dá)下降和分布異常以及細(xì)胞骨架的重排。利用Transwell培養(yǎng)IPEC-1細(xì)胞細(xì)曹感染模型研究PR39對細(xì)菌粘附與入侵,以及細(xì)胞通透性的影響發(fā)現(xiàn),兩種試驗設(shè)計(2μg/mL PR39預(yù)處理IPEC-1細(xì)胞后不洗去直接進(jìn)行細(xì)菌感染,或洗去后再進(jìn)行細(xì)菌感染)均能顯著減少沙門氏菌的入侵?jǐn)?shù)和大腸桿菌的粘附數(shù)(P0.05),且體外抑菌試驗結(jié)果顯示PR39濃度為2 μg/mL時對沙門氏菌和大腸桿菌都沒有抗菌活性。測定各組細(xì)胞TER值發(fā)現(xiàn),PR39能顯著緩解細(xì)菌感染導(dǎo)致的IPEC-1細(xì)胞通透性升高(P0.05)。以上結(jié)果提示抗菌肽PR39可能通過增強腸道上皮細(xì)胞屏障功能發(fā)揮了抗細(xì)菌粘附與入侵的作用,而不是通過其抗菌作用實現(xiàn)的。(2)單獨添加抗菌肽PR39對豬腸道上皮細(xì)胞屏障功能的影響利用研究緊密連接蛋白組裝的經(jīng)典方法Calcium Switch,進(jìn)一步研究單獨添加PR39對上皮細(xì)胞通透性及緊密連接蛋白Occludin表達(dá)的影響。結(jié)果表明,在細(xì)胞培養(yǎng)基中缺鈣再恢復(fù)鈣離子后,2μg/mL及以上濃度PR39處理組的TER值恢復(fù)速度顯著快于對照組,而且0.5μg/mL以上濃度處理組均能提高IPEC-1細(xì)胞Occludin蛋白的表達(dá)。上述結(jié)果表明抗菌肽PR39可促進(jìn)緊密連接蛋白Occludin的表達(dá),調(diào)節(jié)腸道上皮細(xì)胞的通透性。(3)基因芯片分析抗菌肽PR39對豬腸道上皮細(xì)胞基因表達(dá)的影響利用基因芯片技術(shù)篩選PR39處理后豬腸道上皮細(xì)胞IPCE-1的差異表達(dá)基因,結(jié)果表明,基因表達(dá)差異達(dá)2倍以上的基因共有138個,其中表達(dá)上調(diào)的基因有134個,下調(diào)的基因為3個。通過MAS 3.0分析得出這些差異表達(dá)基因涉及的通路包括Tight junction. Regulation of actin cytoskeleton 和 Pathogenic Escherichia coli infection-EHEC等與本研究密切相關(guān)的信號通路,這些通路多涉及Rho小G蛋白家族(Rho GTPase)、WASL、PRKAA1及MAP3K5等基因,其中與Rho GTPase家族成員相關(guān)的通路最多。(4)抗菌肽PR39調(diào)控豬腸道上皮細(xì)胞緊密連接蛋白的分子機制研究由于基因芯片結(jié)果的啟發(fā),從FRho GTPase家族入手,進(jìn)一步研究PR39調(diào)節(jié)腸道上皮細(xì)胞屏障功能的分子機制。G-LISA法測定細(xì)胞中RhoA,Racl和Cdc42的活化水平試驗結(jié)果表明,抗菌肽PR39處理細(xì)胞5 min和24 h后,IPEC-1細(xì)胞Rac1的活化量較正常對照組顯著升高(P0.05),而RhoA與Cdc42均無顯著變化。利用Rac1的專一抑制劑NSC 23766研究抑制Racl的活化后對PR39作用的影響,結(jié)果表明,抑制Rac1的活化后,PR39對豬腸道上皮細(xì)胞通透性的改善作用及對Occludin表達(dá)量的提升作用均受到抑制。而且,PR39對沙門氏菌入侵和大腸桿菌粘附的減少作用也被部分抑制。上述結(jié)果表明抗菌肽PR39通過促進(jìn)Rho GTPase家族成員Racl的活化調(diào)控腸道上皮細(xì)胞屏障功能。上述研究一方面為通過營養(yǎng)手段調(diào)控豬內(nèi)源抗菌肽的表達(dá)而提高仔豬的抗病力,減少甚至替代抗生素的使用提供了新的思路和理論依據(jù),另一方面為將抗菌肽開發(fā)為治療人類及畜禽細(xì)菌感染的藥物提供了新的候選肽,具有重要的指導(dǎo)意義。
文內(nèi)圖片：
圖片說明：圖１．１腸道黏膜上皮屏障的組成逡逑Ｆｉｇ．邋１．１邋Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ邋ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ邋ｂａｒｒｉｅｒ邋ｓｙｓｔｅｍ逡逑
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S858.28

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本文編號：2510577