發(fā)布時(shí)間：2019-07-11 09:00

【摘要】：J亞群禽白血病病毒(Avian leucosis virus subgroup J,ALV-J)屬于反轉(zhuǎn)錄病毒,可以引起雞免疫抑制和多發(fā)性腫瘤。由于ALV-J變異速度快,機(jī)體較難獲得有效的免疫保護(hù),目前尚無(wú)防治該病的有效疫苗。天然免疫是機(jī)體抗感染的首要防線,病毒入侵后會(huì)被天然免疫系統(tǒng)識(shí)別,進(jìn)而引發(fā)相關(guān)免疫通路的活化和抗病毒反應(yīng)。天然免疫識(shí)別受體中Nod樣受體(Nod-like receptors,NLRs)、RIG-I樣受體(RIG-I-Iike receptors,RLRs)在抗RNA病毒中發(fā)揮著重要作用。本研究對(duì)ALV-J感染早期時(shí)黑色素瘤分化相關(guān)基因5(MDA5)及核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptors,NLRs)家族成員NLRP3炎癥轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及調(diào)控機(jī)制進(jìn)行探討,為揭示ALV-J致病機(jī)制和宿主抗病毒免疫機(jī)制提供參考。首先,將本實(shí)驗(yàn)室分離的ALV-J臨床株(命名為AJV-HF211)進(jìn)行DF-1細(xì)胞增殖和鑒定,再將70只1日齡SPF雞隨機(jī)分為兩組,攻毒組42只,對(duì)照組28只,經(jīng)頸部皮下接種ALV-HF211細(xì)胞毒,0.2mL/只,2 x 104TCID50/mL,對(duì)照組接種細(xì)胞培養(yǎng)液,0.2mL/只。在感染不同天數(shù)后(days post infection,dpi)剖檢觀察病變,取肝臟制備石蠟切片。結(jié)果表明,攻毒組雞胸腺出血、萎縮,肝臟和脾臟有出血點(diǎn),膽囊萎縮、膽汁量少且呈淡黃色。此外,AJV-HF211毒株感染組織中炎性細(xì)胞增殖明顯。其次,通過(guò)RT-PCR方法檢測(cè)雞肝組織中病毒的核酸片段并設(shè)計(jì)擴(kuò)增MDA5、 NLRP3及其下游caspase-1及細(xì)胞因子IL-1β、1L-18、IFN-β和IFN-γ基因片段的特異性引物,進(jìn)一步建立SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光相對(duì)定量RT-PCR檢測(cè)方法(RT-qPCR),分別檢測(cè)感染組和對(duì)照組雞肝組織內(nèi)的MDA5、NLRP3及其下游接頭分子和細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄水平。RT-PCR檢測(cè)ALV-J結(jié)果表明,在感染9dpi,首次檢測(cè)到ALV-J特異性基因片段,且9-17dpi期間均能檢測(cè)到該片段的存在。FT-qPCR結(jié)果表明,與未攻毒的對(duì)照組相比,AJV-HF211毒株感染可誘導(dǎo)雞體內(nèi)MDA5. NLRP3及其下游caspase-1、IL-1β 和 IL-18基因的轉(zhuǎn)錄水平均有不同程度增加,而IFN-β和IFN-γ的表達(dá)無(wú)明顯變化。其中,NLRP3/caspase-1在1-3 dpi表達(dá)變化不明顯,而在5-7 dpi時(shí)明顯升高(p0.01),在9dpi開始下降；IL-1β、IL-18 在 1-5dpi無(wú)明顯變化,在7-17dpi表達(dá)量明顯升高(p0.05)。這表明炎癥初期NLRP3轉(zhuǎn)錄水平顯著增加,且變化趨勢(shì)和caspase-1、IL-1β和IL-18基因基本一致。MDA5在1-5dpi時(shí)變化不明顯,但在7-17dpi保持較高轉(zhuǎn)錄水平趨勢(shì)。上述結(jié)果提示,NLRP3/ caspase-1炎癥通路和MDA5受體在AJV-HF211感染早期可能發(fā)揮重要作用,而AJV-HF211毒株可能通過(guò)負(fù)向調(diào)控干擾素誘生機(jī)制逃逸免疫應(yīng)答。最后,將雞飼養(yǎng)至240日齡,觀察腫瘤發(fā)生情況,并取肝臟組織制作石蠟切片,HE染色觀察細(xì)胞狀態(tài)。結(jié)果表明,AJV-HF211毒株感染部分雞精神萎靡,食欲不振,羽毛蓬亂,伴有腹瀉消瘦,貧血等癥狀；剖檢觀察到肝臟、心臟、卵巢均有實(shí)質(zhì)性增生物出現(xiàn)。石蠟切片HE染色結(jié)果表明,攻毒組肝臟有明顯的腫瘤灶,表現(xiàn)為髓細(xì)胞瘤和血管瘤。此外,還可見淋巴樣細(xì)胞浸潤(rùn),肝細(xì)胞索消失,細(xì)胞核崩解等病理變化。上述結(jié)果表明,本實(shí)驗(yàn)室AJV-HF211分離毒株經(jīng)人工感染可對(duì)部分感染雞具有致瘤性,其致瘤作用可能與雞本身抗性有關(guān)。綜上所述,AJV-HF211毒株感染早期和后期均可導(dǎo)致病雞發(fā)生明顯病變,并具有致瘤性。在感染早期時(shí)可誘導(dǎo)MDA5 及 NLRP3/caspase-1炎癥通路的明顯上調(diào),但I(xiàn)FN-β 和 IFN-γ誘生受阻,這可能與ALV-J免疫逃逸有關(guān)。
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圖片說(shuō)明： 失ＲＩＧ－Ｉ［巧�；�于雞先天性缺失ＲＩＧ－Ｉ基因，ＲＩＧ－Ｉ或ＭＤＡ５缺陷小鼠都對(duì)ＲＮＡ逡逑病毒感染更敏感。一些研究者認(rèn)為雞會(huì)更容易感染ＡＩＶ，另外一些研究者則認(rèn)為逡逑ＲＩＧ－Ｉ樣受體家族的ＭＤＡ５會(huì)在功能上彌補(bǔ)這個(gè)缺失。有研究顯示，ＭＤＡ５的逡逑大量表達(dá)可誘導(dǎo)ＩＦＮ－Ｐ的表達(dá)，且呈正相關(guān)口３］。逡逑７．１．１邋ＭＤＡ５介導(dǎo)的抗病毒信號(hào)通路逡逑ＭＤＡ５既可Ｗ識(shí)別單鏈ＲＮＡ又可識(shí)別雙鏈ＲＮＡ病毒，當(dāng)病毒侵入宿主細(xì)逡逑胞后，分別被ＲＩＧ－Ｉ和ＭＤＡ５識(shí)別，隨后都必需通過(guò)定位在線粒體上一重要接逡逑頭蛋白線粒體抗病毒信號(hào)分子ＭＡＶＳ（也稱作ＩＰＳ－１、ＣＡＲＤＩＦ和ＶＩＳＡ）激活下游逡逑通路致使ＩＲＦ３發(fā)生x鎪嶧�并活化Ｍ。ＭＡ｀崜砟Ｎ末端含有ＣＡ＿b慕峁褂潁�介辶x系劑擻耄遙蹋遙簀澹茫粒遙慕峁褂虻南嗷プ饔茫�Ｃ末端结构域使ＭＡ｀崅颞屋x諳吡Ｌ逋忮義夏ど�，线粒体定螝g裕停粒鄭有惺構(gòu)δ苤涼刂匾�綌Q＃停粒鄭誘心跡裕遙粒疲常�招募到辶x希停粒鄭由系模裕遙粒疲撤⑸�Ｋ６３螠o�綋砟泛素化，，进而招募并激涣`っ福裕攏耍焙灣義希桑耍耍�ｉ对Ｉ＿b疲常�Ｉ＿b疲方�行y酸化活化修飾，活化的ＩＲＦ３／ＩＲＦ７轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核，啟逡逑動(dòng)Ｉ型干擾素的產(chǎn)生（圖巧。逡逑旅邐ＲＮＡ逡逑？ｖ腿邋＊？＞＊ｔｋ＊＞＊
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