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NOD2在綿羊肺炎支原體誘導巨噬細胞自噬中的作用機制

發(fā)布時間:2020-11-20 06:04
   綿羊肺炎支原體(Mycoplasna ovipneumoniae,MO)引起的綿羊傳染性胸膜肺炎(Contagious ovine pleuropneumonia)對養(yǎng)羊業(yè)的發(fā)展造成嚴重的威脅。自噬是真核細胞中保守的降解途徑,亦可降解侵入性病原體,在細胞的生存、抗感染免疫等方面起著重要作用。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)MO可以誘導小鼠巨噬細胞RAW264.7自噬,且自噬抑制了 MO在胞內(nèi)的增殖。研究認為,核苷酸結合寡聚結構域蛋白2(nucleotidebindingoligamerization domain 2,NOD2)作為胞內(nèi)模式識別受體,能夠識別侵入的病原菌,誘導細胞自噬;并且可以通過激活JNK途徑引發(fā)下游反應以抵抗病原菌感染。然而,在MO感染RAW264.7過程中,JNK-Bcl-2/Beclin1通路是否參與MO誘導的RAW264.7自噬;NOD2是否可以識別MO;在MO誘導的RAW264.7自噬過程中,NOD2與JNK-Bc1-2/Beclin1存在怎樣的聯(lián)系?相關問題,有待闡明。本研究首先采用MO感染RAW264.7細胞,通過激活、抑制或干擾NOD2,結合免疫熒光、RT-PCR、WesternBlot和mRFP-GFP-LC3雙熒光標記蛋白等技術,分別從形態(tài)學水平和分子水平,探討NOD2對MO誘導RAW264.7細胞自噬的調(diào)控作用。通過上述實驗,獲得研究結果如下:1.MO感染RAW264.7細胞后,NOD1蛋白表達無顯著差異;NOD2蛋白表達趨勢與MO誘導的自噬水平相一致。激活NOD2后,自噬體與MO共定位數(shù)量增多;抑制NOD2后,結果相反。實驗結果證實,NOD2參與MO誘導的RAW264.7自噬,而NOD1不參與此過程。2.MO感染RAW264.7細胞后,當過表達NOD2時,自噬流增強,自噬相關基因和蛋白Atg5、Atg7、Beclin1、LC311/1表達水平升高,且限制胞內(nèi)MO的增殖;當NOD2表達被抑制時,結果相反。表明NOD2參與調(diào)控MO誘導的RAW264.7細胞自噬過程,并對MO在RAW264.7細胞中的增殖具有明顯的影響。3.MO感染RAW264.7細胞后,胞內(nèi)p-JNK1/2、LC3-I1/I表達量升高,自噬小體顯著增多;當sp600126抑制JNK后,p-JNK1/2、LC3-Ⅱ/I表達量降低,自噬小體減少。結果證明JNK參與調(diào)控了 MO誘導的RAW264.7細胞自噬。4.MO感染RAW264.7細胞后,當過表達NOD2時,p-JNK、p-Bc1-2、Beclin1表達水平升高;而干擾NOD2后,結果相反,表明NOD2可以調(diào)控JNK通路。sp600126抑制JNK通路后,NOD2對MO誘導的RAW264.7細胞自噬不再具有調(diào)控作用。即NOD2調(diào)控MO誘導的RAW264.7自噬依賴于JNK-Bc1-2/Beclinl通路。研究結果表明,激活NOD2后促進MO誘導的R。AW264.7自噬,抑制/干擾NOD2后MO誘導的RAW264.7自噬水平降低,且NOD2通過調(diào)控RAW264.7自噬限制胞內(nèi)MO增殖;進一步研究發(fā)現(xiàn)NOD2通過依賴性JNK-Bcl-2/Beclinl途徑參與MO感染所誘導的RAW264.7 自噬。
【學位單位】:寧夏大學
【學位級別】:碩士
【學位年份】:2018
【中圖分類】:S852.62
【部分圖文】:

自噬,細胞


與溶酶體融合降解貨物的過程。微自噬通過溶酶體膜或液泡膜的變形直接包裹長壽命蛋白及??特定細胞器[48],并通過溶酶體在胞內(nèi)降解[49]。伴侶介導的自噬是調(diào)節(jié)特定的可溶性胞質(zhì)蛋??白的選擇性功能自噬,其選擇性是由細胞質(zhì)底物中的靶向基序KFERQ所賦予的[5°](圖1-??2)。隨著自噬研宄的深入,已經(jīng)發(fā)現(xiàn)自噬可以在特定情況下特異性降解某些類型的大分子或??細胞器,這種自嗟被稱為選擇性自噬[51],包括線粒體自噬(Mitophagy)、脂類自噬(Lipophagy)、??內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自嗤(Reticulophagy)、異源自噻(Xenophagy)等[52_54],選擇性自嗤依賴于特定的受??體蛋白來完成特定貨物的吞噬作用,通常包括OPTN、NBR1、NDP52、NIX?(NIP3樣蛋白??X)和?FUNDC1?(含有?1?個?FUN14?結構域)[55’56]。??<lJ^KFERQ?M〇tlf?Chaperone?N.??/?Chaperone-mediated?\??/?autophagy?\??l?UMP2Ag^P?^^?\??l繼命頌一?/??\?Microautophagy?J??Macroautophagy?\??圖1-2細胞自噬的分類[57]??Fig?1-2?Three?type?of?autophagy^57^??-3?-??

家族,結構域


知細胞質(zhì)中的微生物產(chǎn)物的PRR。??NLR家族根據(jù)它們的N-末端結構域的不同又分為五個亞家族:NLRA、NLRB、NLRC、??NLRP、NLRX?(圖1>4)。這些亞家族含有一個酸反式激活結構域,一個桿狀病毒抑制劑重??復序列和一個半胱天冬酶募集結構域(caspase-recrutingdomain,?CARD)或Pyrin結構域[85]。??NLRC?亞族包括五種蛋白質(zhì):NODI、NOD2、NLRC3、NLRC4、NLRC5。??核苷酸結合寡聚結構域?1?(nucleotidebindingoligamerizationdomain?1,?NODI)和核昔??酸結合寡聚結構域?2?(nucleotide?binding?oligamerization?domain?2,?NOD2)蛋白是首先被識??別的NLRsP'也是家族中研宄最廣泛的成員。NODI蛋白含有953個氨基酸,分子量為??97kDa;而NOD2蛋白含有1040個氨基酸,分子量為110kD[8Sl。NOD1和NOD2具有相似??-6-??

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寧夏大學碩士學位論文?第二章N0D2參與M0誘導的RAW264.7細胞自噬過儀器名稱????電泳儀?Power?pac?HV?美國BIO-RAD公司??轉膜儀?Trans-Blot?SD?Cell?美國?BIO-RAD?公司??酶標儀?680?美國BIO-RAD公司??C02培養(yǎng)箱?311?美國Thermo公司??熒光倒置顯微鏡?AE31?中國MOTIC公司??正置熒光顯微鏡?DM2500?德國Leica公司??恒溫震蕩孵化儀?Thermomixer?comfort?德國EPFENDORF公司??化學發(fā)光檢測儀?E5311?美國Promega公司??Odyssey?Sa?OSA-0315?上;蚬??2.2技術路線??MO誘導RAW264.7細胞
【參考文獻】

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本文編號:2891058

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