發(fā)布時間：2020-11-20 06:04

　　 綿羊肺炎支原體(Mycoplasna ovipneumoniae，MO)引起的綿羊傳染性胸膜肺炎(Contagious ovine pleuropneumonia)對養(yǎng)羊業(yè)的發(fā)展造成嚴(yán)重的威脅。自噬是真核細(xì)胞中保守的降解途徑,亦可降解侵入性病原體,在細(xì)胞的生存、抗感染免疫等方面起著重要作用。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)MO可以誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7自噬,且自噬抑制了 MO在胞內(nèi)的增殖。研究認(rèn)為,核苷酸結(jié)合寡聚結(jié)構(gòu)域蛋白2(nucleotidebindingoligamerization domain 2,NOD2)作為胞內(nèi)模式識別受體,能夠識別侵入的病原菌,誘導(dǎo)細(xì)胞自噬;并且可以通過激活JNK途徑引發(fā)下游反應(yīng)以抵抗病原菌感染。然而,在MO感染RAW264.7過程中,JNK-Bcl-2/Beclin1通路是否參與MO誘導(dǎo)的RAW264.7自噬;NOD2是否可以識別MO;在MO誘導(dǎo)的RAW264.7自噬過程中,NOD2與JNK-Bc1-2/Beclin1存在怎樣的聯(lián)系?相關(guān)問題,有待闡明。本研究首先采用MO感染RAW264.7細(xì)胞,通過激活、抑制或干擾NOD2,結(jié)合免疫熒光、RT-PCR、WesternBlot和mRFP-GFP-LC3雙熒光標(biāo)記蛋白等技術(shù),分別從形態(tài)學(xué)水平和分子水平,探討NOD2對MO誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞自噬的調(diào)控作用。通過上述實驗,獲得研究結(jié)果如下:1.MO感染RAW264.7細(xì)胞后,NOD1蛋白表達(dá)無顯著差異;NOD2蛋白表達(dá)趨勢與MO誘導(dǎo)的自噬水平相一致。激活NOD2后,自噬體與MO共定位數(shù)量增多;抑制NOD2后,結(jié)果相反。實驗結(jié)果證實,NOD2參與MO誘導(dǎo)的RAW264.7自噬,而NOD1不參與此過程。2.MO感染RAW264.7細(xì)胞后,當(dāng)過表達(dá)NOD2時,自噬流增強(qiáng),自噬相關(guān)基因和蛋白Atg5、Atg7、Beclin1、LC311/1表達(dá)水平升高,且限制胞內(nèi)MO的增殖;當(dāng)NOD2表達(dá)被抑制時,結(jié)果相反。表明NOD2參與調(diào)控MO誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞自噬過程,并對MO在RAW264.7細(xì)胞中的增殖具有明顯的影響。3.MO感染RAW264.7細(xì)胞后,胞內(nèi)p-JNK1/2、LC3-I1/I表達(dá)量升高,自噬小體顯著增多;當(dāng)sp600126抑制JNK后,p-JNK1/2、LC3-Ⅱ/I表達(dá)量降低,自噬小體減少。結(jié)果證明JNK參與調(diào)控了 MO誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞自噬。4.MO感染RAW264.7細(xì)胞后,當(dāng)過表達(dá)NOD2時,p-JNK、p-Bc1-2、Beclin1表達(dá)水平升高;而干擾NOD2后,結(jié)果相反,表明NOD2可以調(diào)控JNK通路。sp600126抑制JNK通路后,NOD2對MO誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞自噬不再具有調(diào)控作用。即NOD2調(diào)控MO誘導(dǎo)的RAW264.7自噬依賴于JNK-Bc1-2/Beclinl通路。研究結(jié)果表明,激活NOD2后促進(jìn)MO誘導(dǎo)的R。AW264.7自噬,抑制/干擾NOD2后MO誘導(dǎo)的RAW264.7自噬水平降低,且NOD2通過調(diào)控RAW264.7自噬限制胞內(nèi)MO增殖;進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)NOD2通過依賴性JNK-Bcl-2/Beclinl途徑參與MO感染所誘導(dǎo)的RAW264.7 自噬。
【學(xué)位單位】：寧夏大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S852.62
【部分圖文】：

與溶酶體融合降解貨物的過程。微自噬通過溶酶體膜或液泡膜的變形直接包裹長壽命蛋白及??特定細(xì)胞器［４８］，并通過溶酶體在胞內(nèi)降解［４９］。伴侶介導(dǎo)的自噬是調(diào)節(jié)特定的可溶性胞質(zhì)蛋??白的選擇性功能自噬，其選擇性是由細(xì)胞質(zhì)底物中的靶向基序ＫＦＥＲＱ所賦予的［５°］（圖１－??２）。隨著自噬研宄的深入，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)自噬可以在特定情況下特異性降解某些類型的大分子或??細(xì)胞器，這種自嗟被稱為選擇性自噬［５１］，包括線粒體自噬（Ｍｉｔｏｐｈａｇｙ）、脂類自噬（Ｌｉｐｏｐｈａｇｙ）、??內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自嗤（Ｒｅｔｉｃｕｌｏｐｈａｇｙ）、異源自噻（Ｘｅｎｏｐｈａｇｙ）等［５２＿５４］，選擇性自嗤依賴于特定的受??體蛋白來完成特定貨物的吞噬作用，通常包括ＯＰＴＮ、ＮＢＲ１、ＮＤＰ５２、ＮＩＸ?（ＮＩＰ３樣蛋白??Ｘ）和?ＦＵＮＤＣ１?（含有?１?個?ＦＵＮ１４?結(jié)構(gòu)域）［５５’５６］。??＜ｌＪ＾ＫＦＥＲＱ?Ｍ〇ｔｌｆ?Ｃｈａｐｅｒｏｎｅ?Ｎ．??／?Ｃｈａｐｅｒｏｎｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ?＼??／?ａｕｔｏｐｈａｇｙ?＼??ｌ?ＵＭＰ２Ａｇ＾Ｐ?＾＾?＼??ｌ繼命頌一?／??＼?Ｍｉｃｒｏａｕｔｏｐｈａｇｙ?Ｊ??Ｍａｃｒｏａｕｔｏｐｈａｇｙ?＼??圖１－２細(xì)胞自噬的分類［５７］??Ｆｉｇ?１－２?Ｔｈｒｅｅ?ｔｙｐｅ?ｏｆ?ａｕｔｏｐｈａｇｙ＾５７＾??－３?－??

知細(xì)胞質(zhì)中的微生物產(chǎn)物的ＰＲＲ。??ＮＬＲ家族根據(jù)它們的Ｎ－末端結(jié)構(gòu)域的不同又分為五個亞家族：ＮＬＲＡ、ＮＬＲＢ、ＮＬＲＣ、??ＮＬＲＰ、ＮＬＲＸ?（圖１＞４）。這些亞家族含有一個酸反式激活結(jié)構(gòu)域，一個桿狀病毒抑制劑重??復(fù)序列和一個半胱天冬酶募集結(jié)構(gòu)域（ｃａｓｐａｓｅ－ｒｅｃｒｕｔｉｎｇｄｏｍａｉｎ，?ＣＡＲＤ）或Ｐｙｒｉｎ結(jié)構(gòu)域［８５］。??ＮＬＲＣ?亞族包括五種蛋白質(zhì)：ＮＯＤＩ、ＮＯＤ２、ＮＬＲＣ３、ＮＬＲＣ４、ＮＬＲＣ５。??核苷酸結(jié)合寡聚結(jié)構(gòu)域?１?（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｂｉｎｄｉｎｇｏｌｉｇａｍｅｒｉｚａｔｉｏｎｄｏｍａｉｎ?１，?ＮＯＤＩ）和核昔??酸結(jié)合寡聚結(jié)構(gòu)域?２?（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ?ｂｉｎｄｉｎｇ?ｏｌｉｇａｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ?ｄｏｍａｉｎ?２，?ＮＯＤ２）蛋白是首先被識??別的ＮＬＲｓＰ＇也是家族中研宄最廣泛的成員。ＮＯＤＩ蛋白含有９５３個氨基酸，分子量為??９７ｋＤａ；而ＮＯＤ２蛋白含有１０４０個氨基酸，分子量為１１０ｋＤ［８Ｓｌ。ＮＯＤ１和ＮＯＤ２具有相似??－６－??

寧夏大學(xué)碩士學(xué)位論文?第二章Ｎ０Ｄ２參與Ｍ０誘導(dǎo)的ＲＡＷ２６４．７細(xì)胞自噬過儀器名稱????電泳儀?Ｐｏｗｅｒ?ｐａｃ?ＨＶ?美國ＢＩＯ－ＲＡＤ公司??轉(zhuǎn)膜儀?Ｔｒａｎｓ－Ｂｌｏｔ?ＳＤ?Ｃｅｌｌ?美國?ＢＩＯ－ＲＡＤ?公司??酶標(biāo)儀?６８０?美國ＢＩＯ－ＲＡＤ公司??Ｃ０２培養(yǎng)箱?３１１?美國Ｔｈｅｒｍｏ公司??熒光倒置顯微鏡?ＡＥ３１?中國ＭＯＴＩＣ公司??正置熒光顯微鏡?ＤＭ２５００?德國Ｌｅｉｃａ公司??恒溫震蕩孵化儀?Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ?ｃｏｍｆｏｒｔ?德國ＥＰＦＥＮＤＯＲＦ公司??化學(xué)發(fā)光檢測儀?Ｅ５３１１?美國Ｐｒｏｍｅｇａ公司??Ｏｄｙｓｓｅｙ?Ｓａ?ＯＳＡ－０３１５?上�；�因公司??２．２技術(shù)路線??ＭＯ誘導(dǎo)ＲＡＷ２６４．７細(xì)胞
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2891058