發(fā)布時(shí)間：2020-11-21 11:03

　　 新孢子蟲病是由犬新孢子蟲寄生于牛、羊和犬等多種動(dòng)物有核細(xì)胞內(nèi)引起的一種原蟲病。機(jī)體感染犬新孢子蟲后幾天內(nèi)會(huì)發(fā)生的壞死性病變,并通過細(xì)胞內(nèi)速殖子的增殖導(dǎo)致細(xì)胞死亡。典型癥狀是母畜流產(chǎn),死胎以及新生胎兒運(yùn)動(dòng)障礙。該病是一種世界范圍性的疾病,分布廣泛,在澳大利亞,日本,韓國以及我國的多個(gè)省份都有發(fā)現(xiàn),給畜牧業(yè)的經(jīng)濟(jì)發(fā)展帶來了巨大影響。但現(xiàn)今仍缺乏有效的疫苗來預(yù)防新孢子蟲病,研究新孢子蟲的入侵機(jī)制和抗原蛋白對新孢子蟲病的預(yù)防和診斷有參考價(jià)值。酵母雙雜交技術(shù)是目前廣泛應(yīng)用研究一種已知蛋白與另一種已知或未知蛋白之間的相互作用情況,具有簡潔性和高敏感性。構(gòu)建誘餌載體是本試驗(yàn)的重要步驟,首先構(gòu)建pGBKT7-NcGRA7載體,為進(jìn)一步研究與NcGRA7基因互作的蛋白奠定基礎(chǔ)。本試驗(yàn)通過PCR方法擴(kuò)增NcGRA7基因,回收的NcGRA7基因先與pMD19T Simple載體連接,轉(zhuǎn)化到DH5α中,進(jìn)行PCR鑒定和酶切鑒定,以獲得含有EcoR Ⅰ和Sal Ⅰ兩種限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)的正確的NcGRA7基因。將pGBKT7載體用EcoRⅠ和Sal Ⅰ兩種限制性內(nèi)切酶酶切,獲得兩端分別含有這兩種酶切位點(diǎn)的pGBKT7載體。并將含有相同酶切位點(diǎn)的NcGRA7基因和pGBKT7載體進(jìn)行連接,轉(zhuǎn)化到DH5α中,篩選出PCR鑒定和酶切鑒定均正確的pGBKT7-NcGRA7重組質(zhì)粒,進(jìn)行測序,與GenBank上的NcGRA7基因序列有100%的同源性。本試驗(yàn)成功地構(gòu)建了 pGBKT7-NcGRA7誘餌載體,為下一步NcGRA7相互作用蛋白的初步篩選奠定基礎(chǔ)。為了保證后續(xù)篩選實(shí)驗(yàn)中能獲得理想的結(jié)果,首先要對之前構(gòu)建的誘餌載體pGBKT7-NcGRA7進(jìn)行自轉(zhuǎn)錄活性和細(xì)胞毒性檢測。鑒定結(jié)果顯示構(gòu)建的誘餌載體pGBKT7-NcGRA7無自轉(zhuǎn)錄活性,無細(xì)胞毒性。將誘餌載體pGBKT7-NcGRA7與Vero細(xì)胞cDNA文庫進(jìn)行雜交篩選,獲得234個(gè)藍(lán)斑克隆,經(jīng)PCR鑒定,質(zhì)粒提取,轉(zhuǎn)化測序等操作后,獲得4個(gè)陽性質(zhì)粒,分別為18S核糖體RNA,70kDa熱休克蛋白8,NADH脫氫酶亞基1(線粒體),低聚糖轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物。
【學(xué)位單位】：延邊大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：Q78;S852.7
【部分圖文】：

３．２?ｐＭＤ１９Ｔ－ＮｃＧＲＡ７的ＰＣＲ鑒定與酶切鑒定??ｐＭＤ１９Ｔ－ＮｃＧＲＡ７的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)中，克隆培養(yǎng)，菌落ＰＣＲ??鑒定，目的基因片５７０ｂｐ，如圖２所示。??１?２?３?４?Ｍ??＿??“‘福麵??圖２?ｐＭＤ１９Ｔ－ＮｃＧＲＡ７的ＰＣＲ鑒定結(jié)果??Ｍ：?ＤＬ５?０００Ｍａｒｋｅｒ；?１、２、３：?ＮｃＧＲＡ７?擴(kuò)增產(chǎn)物：４：空白對照??Ｆｉｇ．２?Ｔｈｅ?ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｔｈｅ?ｐＭＤ１９Ｔ－ＮｃＧＲＡ７?ｂｙ?ＰＣＲ??Ｍ：?ＤＬ５?０００?Ｍａｒｋｅｒ；?Ｋ?２＞?３：?ＰＣＲ?ｐｒｏｄｕｃｔｓ?ｏｆ?ＮｃＧＲＡ７?ｇｅｎｅ；?４：Ｃｏｎｔｒａｓｔ??１５??

結(jié)果??３．１?ＮｃＧＲＡ７基因的擴(kuò)增??ＮｃＧＲＡ７擴(kuò)增結(jié)果與預(yù)期片段大小一致，５７０ｂｐ，如圖１。??１?２?Ｍ??ｗ：．．．?…?????７５０ｂｐ??５７０ｂｐ?—＇?Ｈ：?＾—?５００ｂｐ??ｇｇｊｍ??圖１?ＮｃＧＲＡ７基因礦增結(jié)果??Ｍ：?ＤＬ５?０００?Ｍａｒｋｅｒ；?１：?ＮｃＧＲＡ７?擴(kuò)增產(chǎn)物；２：空白對照??Ｆｉｇ．?１?Ｔｈｅ?ｒｅｓｕｌｔ?ｏｆＮｃＧＲＡ７?ｇｅｎｅ?ＰＣＲ?ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ??Ｍ：?ＤＬ５?０００?Ｍａｒｋｅｒ；?１?：?ＰＣＲ?ｐｒｏｄｕｃｔｓ?ｏｆ?ＮｃＧＲＡ７?ｇｅｎｅ；?２：Ｃｏｎｔｒａｓｔ??３．２?ｐＭＤ１９Ｔ－ＮｃＧＲＡ７的ＰＣＲ鑒定與酶切鑒定??ｐＭＤ１９Ｔ－ＮｃＧＲＡ７的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)中，克隆培養(yǎng)，菌落ＰＣＲ??鑒定，目的基因片５７０ｂｐ，如圖２所示。??１?２?３?４?Ｍ??＿??“‘福麵??圖２?ｐＭＤ１９Ｔ－ＮｃＧＲＡ７的ＰＣＲ鑒定結(jié)果??Ｍ：?ＤＬ５?０００Ｍａｒｋｅｒ；?１、２、３：?ＮｃＧＲＡ７?擴(kuò)增產(chǎn)物：４：空白對照??Ｆｉｇ．２?Ｔｈｅ?ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｔｈｅ?ｐＭＤ１９Ｔ－ＮｃＧＲＡ７?ｂｙ?ＰＣＲ??Ｍ：?ＤＬ５?０００?Ｍａｒｋｅｒ；?Ｋ?２＞?３：?ＰＣＲ?ｐｒｏｄｕｃｔｓ?ｏｆ?ＮｃＧＲＡ７?ｇｅｎｅ；

圖３?ｐＭＤ１９Ｔ－ＮｃＧＲＡ７雙酶切鑒定??Ｍ：?ＤＬ５?０００?Ｍａｒｋｅｒ；?ｈ?ＮｃＧＲＡ７；?２：空白對照??ｅｎｔｉｃａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｐＭＤ１９Ｔ－ＮｃＧＲＡ７?ｂｙ?ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ?ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ?ｄｉｇＤＬ５?０００?Ｍａｒｋｅｒ；?１?：?ＰＣＲ?ｐｒｏｄｕｃｔｓ?ｏｆ?ＮｃＧＲＡ７?ｇｅｎｅ；?２：Ｃｏｎｔ析??后，結(jié)果顯示序列與ＮＣＢＩ中ＮｃＧＲＡ７序列同源列如圖４所不。??１０?２０?３０?４０?ＳＯ?６Ｄ??Ａ＇ＧＡＡＴＴ?ＯＧ?ＡＧＡ?ＴＴＧＯＣＡ?Ａ?ＧＡＡ：ＡＧ：?ＡＴＧＡＡＧＧＧＧＡ?．．?ＡＴ?ＧＧＡ．ＴＡＴ?ＧＧＧＧＴＴＡＧＧＧ??７０?８０?９０?１００?１１０?１２０??ＡＴＡＴＧ＇＾ＧＧ?：ＧＴＴＴ?ＡＪｌＡＣ?ＴＡＴＧＡ?：ＧＧｖ?Ｇ?ｋＴＧｋ＇ＯｋＴＯ：．?ＴＧＣ．ＡＧＧＡＡＡ?ＴＧＴ．ＧｆＴ??１３０?１４０?１５０?１６０?１７０?１８０??ＣＧＧＡＴＧＴＧＡ?．?ＴＧＡＣＧＡＴＧＣＣ?ＡＴＴＡ?夂ＧＡＴＧ?ＧＴＧＡＧＴＧＧＣＣ?Ａ?Ｃ’ＴＧＴＴＧＴＡ?Ｔ：ＧＧＧＧｆＡＧＡ??１９０?２００?２１０?２２０?２３０?２４０??ＡＧＣｖＧＣＡ?Ａ＇?ＧＡＣＴ?ＡＧＡＡＡ?ＧＧ＇ｌＡＧ?ＴＴＧＡ?Ｔ?．＾ＧＡＡＧ＾Ｔ?ＧＧ?ＡＧＴＡ?Ｇ?ＧＴＧＧＴＣＧＧＣＧ??２５０?２６０?２７０?２８０?２ＳＯ?３００??＂ＴＣＴＴＡＣＧＴ．－?ＧＴＡＴ?ＴＴＧＴＴ?Ｇ?ＴＧＡ－ＡＧＧＧ?ＴＧ?ＴＧ?ＧＡ?ＧＴＴＧＡ；ＴＴ?Ｔ?Ｇ?：?ＡＧＡＡＧＡＡ０??３１０?３２０?３３０?３４０?３Ｓ０?３?６０??－－
【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)博士學(xué)位論文 前3條

1 馬磊;新孢子蟲ROP5和ROP16的功能及作用機(jī)制[D];中國農(nóng)業(yè)大學(xué);2017年

2 李文生;新孢子蟲MIC6的鑒定、功能及其作用機(jī)制的初步研究[D];中國農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

3 賈立軍;牛源犬新孢子蟲NcSRS2-NcGRA7復(fù)合基因核酸疫苗與重組腺病毒疫苗的研究[D];延邊大學(xué);2012年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前3條

1 楊東升;新孢子蟲NcMIC2-like1重組蛋白對小鼠新孢子蟲感染的免疫保護(hù)作用[D];吉林大學(xué);2016年

2 郭煥平;牛源犬新孢子蟲AMA1基因核酸疫苗與重組腺病毒疫苗的制備及動(dòng)物免疫[D];延邊大學(xué);2014年

3 甘甜;CG31007基因誘餌質(zhì)粒的構(gòu)建與檢測[D];湖北大學(xué);2014年

本文編號：2892915