JNK促進(jìn)甲型流感病毒復(fù)制的分子機(jī)制
發(fā)布時(shí)間:2020-12-04 16:00
A型流感病毒(Influenza A Virus,IAV)廣泛感染禽類與哺乳動(dòng)物,而B(niǎo)型流感病毒只感染人類;诓《颈砻嫣堑鞍籽兀℉A)和神經(jīng)氨酸酶(NA)的不同組合,IAV可以進(jìn)一步分為多種亞型。目前為止,共鑒定出17種HA和10種NA。其中一些重組的IAV基因型(包括H5N1,H9N2,H7N2和H6N5)會(huì)引起人類的致命性感染。自噬是細(xì)胞對(duì)受損細(xì)胞器,廢舊蛋白和入侵微生物進(jìn)行吞噬降解和再利用的過(guò)程,已有越來(lái)越多的自噬相關(guān)蛋白被發(fā)現(xiàn)參與自噬的形成。自噬由液泡排列相關(guān)蛋白34(VPS34)活化引起,VPS34是種已知的III型磷脂酰肌醇激酶(PI3K-III),其磷酸化底物磷脂酰肌醇(PI3P)可以和Beclin-1,ATG14L,VSP15組成蛋白復(fù)合物,為自噬小體形成所必需。ULK1是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶,可以與自噬相關(guān)蛋白13(ATG13)和分子量大小為200kD的黏著斑激酶家族相互作用蛋白(FIP200)相互作用。VPS34由ULK1激活,激活后PI-4,5將會(huì)被催化成PI3P,活化的蛋白復(fù)合物將用于參與自噬雙層膜的形成并延長(zhǎng)形成自噬體。ULK1的活性受哺乳動(dòng)物雷帕霉素...
【文章來(lái)源】:揚(yáng)州大學(xué)江蘇省
【文章頁(yè)數(shù)】:52 頁(yè)
【學(xué)位級(jí)別】:碩士
【部分圖文】:
圖1.?IAV在CEF和DF1細(xì)胞中誘導(dǎo)LC-3脂質(zhì)化和p62降解
??接下來(lái),我們用共聚焦顯微鏡檢測(cè)來(lái)觀察三種不同的IAV病毒是否也差異性誘導(dǎo)自噻??小體的形成。如圖2B所示,H5N1誘導(dǎo)的自噬小體成核周分布,和陽(yáng)性對(duì)照雷帕霉素誘導(dǎo)??的細(xì)胞自噬相似。而H1N1誘導(dǎo)的自噬小體非常大聚集分布在核的一邊。H9N2病毒誘導(dǎo)??的自噻小體大多分布在細(xì)胞核附近一側(cè)。三種亞型IAV病毒均能誘導(dǎo)30%左右的細(xì)胞量產(chǎn)??生自噬,陽(yáng)性對(duì)照雷帕霉素能誘導(dǎo)15%左右的細(xì)胞產(chǎn)生自嗤(圖2C)。??A?B??DAPI?GFP-LC3?Merge??則:'??圖2.三種亞型流感病毒差異性誘導(dǎo)細(xì)胞自噬。(A)不同IAV亞型(H5N1,?H9N2,?H1N1)用指定濃??度感染0£?細(xì)胞24小時(shí)。裂解細(xì)胞后用^^51611181〇1檢測(cè)1£:3-11,?62,^11,及^-3(:1;:111的蛋白表達(dá)水??平。(B)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染表達(dá)pmLC3-GFP的DF-1細(xì)胞分別感染H5N1?(0.1?MOI),?H9N2?(1?MOI)和H〗N1?(1??MOI)。雷帕霉素(50nM)作用未感染細(xì)胞作為陽(yáng)性對(duì)照。藥物作用或病毒感染12小時(shí)后,在共聚焦??顯微鏡下觀察自噬小體。比例尺,25pm。計(jì)算產(chǎn)生自噬小體的GRP陽(yáng)性表達(dá)的DF1細(xì)胞比例,并繪制??條形圖。(*p<0.05;**p<0.01)。??
and?plotted?in?a?bar?graph?with?statistical?analysis?(C).?*p<0.05;?**p<0.01.??為了驗(yàn)證H5N1病毒誘導(dǎo)細(xì)胞完全自噬的能力,我們分別用巴弗洛霉素A(Bafilomycin??A,Baf)和氯唾(Chloroquine,CQ)兩種自噬抑制劑來(lái)阻斷自噬流的形成。;碑過(guò)圖3A&B??可以發(fā)現(xiàn),CQ和Baf增強(qiáng)了?H5N1誘導(dǎo)的LC3-II的增加,并阻斷了由H5N1誘導(dǎo)引起的??p62的降解。與此相反的是,CQ和Baf對(duì)H1N1感染細(xì)胞中的p62水平與LC3-II的變化??幾乎沒(méi)有影響。DF1細(xì)胞感染H5N1病毒的熒光共聚焦結(jié)果同樣可以證明,H5N1誘導(dǎo)細(xì)??胞完全自噬。如圖3C所示,Baf?(10nM)或者H5N1病毒(0.1MOI)可以顯著增加自噻??小體的形成,表現(xiàn)為GFP-LC3熒光聚點(diǎn)的數(shù)量增加。DF1細(xì)胞感染H5N1病毒后加入Baf??可以進(jìn)一步增加GFP-LC3熒光聚點(diǎn)的數(shù)量(圖3D)。?備??我們接下來(lái)驗(yàn)證是否阻斷了自噬會(huì)影響IAV的胞內(nèi)復(fù)制。如圖3E所示,CEF細(xì)胞感??染H5N1后加入Baf,分別檢測(cè)胞內(nèi)病毒蛋白的含量和細(xì)胞培養(yǎng)上清中病毒蛋白的含量。??結(jié)果顯示
本文編號(hào):2897876
【文章來(lái)源】:揚(yáng)州大學(xué)江蘇省
【文章頁(yè)數(shù)】:52 頁(yè)
【學(xué)位級(jí)別】:碩士
【部分圖文】:
圖1.?IAV在CEF和DF1細(xì)胞中誘導(dǎo)LC-3脂質(zhì)化和p62降解
??接下來(lái),我們用共聚焦顯微鏡檢測(cè)來(lái)觀察三種不同的IAV病毒是否也差異性誘導(dǎo)自噻??小體的形成。如圖2B所示,H5N1誘導(dǎo)的自噬小體成核周分布,和陽(yáng)性對(duì)照雷帕霉素誘導(dǎo)??的細(xì)胞自噬相似。而H1N1誘導(dǎo)的自噬小體非常大聚集分布在核的一邊。H9N2病毒誘導(dǎo)??的自噻小體大多分布在細(xì)胞核附近一側(cè)。三種亞型IAV病毒均能誘導(dǎo)30%左右的細(xì)胞量產(chǎn)??生自噬,陽(yáng)性對(duì)照雷帕霉素能誘導(dǎo)15%左右的細(xì)胞產(chǎn)生自嗤(圖2C)。??A?B??DAPI?GFP-LC3?Merge??則:'??圖2.三種亞型流感病毒差異性誘導(dǎo)細(xì)胞自噬。(A)不同IAV亞型(H5N1,?H9N2,?H1N1)用指定濃??度感染0£?細(xì)胞24小時(shí)。裂解細(xì)胞后用^^51611181〇1檢測(cè)1£:3-11,?62,^11,及^-3(:1;:111的蛋白表達(dá)水??平。(B)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染表達(dá)pmLC3-GFP的DF-1細(xì)胞分別感染H5N1?(0.1?MOI),?H9N2?(1?MOI)和H〗N1?(1??MOI)。雷帕霉素(50nM)作用未感染細(xì)胞作為陽(yáng)性對(duì)照。藥物作用或病毒感染12小時(shí)后,在共聚焦??顯微鏡下觀察自噬小體。比例尺,25pm。計(jì)算產(chǎn)生自噬小體的GRP陽(yáng)性表達(dá)的DF1細(xì)胞比例,并繪制??條形圖。(*p<0.05;**p<0.01)。??
and?plotted?in?a?bar?graph?with?statistical?analysis?(C).?*p<0.05;?**p<0.01.??為了驗(yàn)證H5N1病毒誘導(dǎo)細(xì)胞完全自噬的能力,我們分別用巴弗洛霉素A(Bafilomycin??A,Baf)和氯唾(Chloroquine,CQ)兩種自噬抑制劑來(lái)阻斷自噬流的形成。;碑過(guò)圖3A&B??可以發(fā)現(xiàn),CQ和Baf增強(qiáng)了?H5N1誘導(dǎo)的LC3-II的增加,并阻斷了由H5N1誘導(dǎo)引起的??p62的降解。與此相反的是,CQ和Baf對(duì)H1N1感染細(xì)胞中的p62水平與LC3-II的變化??幾乎沒(méi)有影響。DF1細(xì)胞感染H5N1病毒的熒光共聚焦結(jié)果同樣可以證明,H5N1誘導(dǎo)細(xì)??胞完全自噬。如圖3C所示,Baf?(10nM)或者H5N1病毒(0.1MOI)可以顯著增加自噻??小體的形成,表現(xiàn)為GFP-LC3熒光聚點(diǎn)的數(shù)量增加。DF1細(xì)胞感染H5N1病毒后加入Baf??可以進(jìn)一步增加GFP-LC3熒光聚點(diǎn)的數(shù)量(圖3D)。?備??我們接下來(lái)驗(yàn)證是否阻斷了自噬會(huì)影響IAV的胞內(nèi)復(fù)制。如圖3E所示,CEF細(xì)胞感??染H5N1后加入Baf,分別檢測(cè)胞內(nèi)病毒蛋白的含量和細(xì)胞培養(yǎng)上清中病毒蛋白的含量。??結(jié)果顯示
本文編號(hào):2897876
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