發(fā)布時間：2020-11-16 17:59

　　 目的:1.探討中電導(dǎo)鈣激活鉀離子通道(IKCa1)對HeLa細(xì)胞增殖、遷移及侵襲特性的影響;2.探究IKCa1對miRNA表達譜的影響,篩選出與IKCa1相關(guān)的miRNA,并通過生物信息學(xué)預(yù)測其靶基因,對其靶基因進行功能分析(GO分析),篩選出差異顯著的mi RNA,,對其靶基因進行信號通路富集分析,初步探索IKCa1相關(guān)miRNA與HeLa細(xì)胞增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移的相關(guān)關(guān)系,為進一步探究mi RNA在預(yù)防和治療宮頸癌的靶標(biāo)分子中提供了線索。方法:1.分別設(shè)置濃度為0、10.0、20.0、30.0、40.0μmol/L TRAM-34(IKCa1特異性阻斷劑)為觀察1-5組及等體積的DMSO組(TRAM-34溶劑)處理HeLa細(xì)胞24h、48h和72h,采用CCK8實驗檢測HeLa細(xì)胞增殖特性;采用劃痕實驗測量HeLa細(xì)胞實際遷移距離從而檢測HeLa細(xì)胞遷移特性;2.按上述6組分組處理HeLa細(xì)胞48小時后用Transwell實驗檢測其侵襲特性;3.通過本研究前期預(yù)實驗、查閱相關(guān)文獻、結(jié)合CCK8實驗及劃痕實驗結(jié)果篩選0.0、30.0μmol/L TRAM-34分別處理HeLa細(xì)胞48小時作為對照組和實驗組,采用高通量測序方法檢測IKCa1阻斷前、后miRNA表達譜的變化;4.采用q RT-PCR法對部分差異顯著表達miRNAs進行驗證,從而驗證高通量測序結(jié)果的準(zhǔn)確性;5.運用mi Randa、miRWalK、Targetscan、DIANAmT、miRDB等軟件預(yù)測篩選的差異顯著表達miRNA可能調(diào)控的靶基因以及GO功能分析;再從表達譜中上調(diào)和下調(diào)的miRNA中各選一個與宮頸癌密切相關(guān)的mi RNA作為研究對象即為靶miRNA,對其靶基因進行信號通路富集分析。結(jié)果:1.CCK8實驗提示TRAM-34抑制HeLa細(xì)胞的增殖,在一定范圍內(nèi),具有劑量依賴性,在培養(yǎng)細(xì)胞24h時DMSO組、觀察1組和觀察2組三組間差異均不具有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05),其余各組與DMSO組及與觀察1組之間具有顯著性差異(p0.001);而培養(yǎng)HeLa細(xì)胞48、72h后,DMSO與觀察1組間差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05),而其余各觀察組與觀察1組、DMSO組之間差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.001),提示本實驗中MDSO濃度對HeLa細(xì)胞無影響;劃痕實驗提示TRAM-34能抑制HeLa細(xì)胞遷移,在一定范圍內(nèi),具有時間及劑量依賴性,隨著濃度增加及作用時間延長,抑制遷移作用越明顯(p0.001))。2.Transwell侵襲實驗證明,在一定濃度范圍內(nèi),HeLa細(xì)胞的侵襲率隨TRAM-34濃度增加呈遞減趨勢(F=384.050,p0.001)。3.分析對照組與實驗組的mi RNA高通量測序結(jié)果,通過對不同樣本的Clear data的比較,分析其共有序列及特有的序列,以Fold Change≧1.5,qvalue0.01為差異顯著表達的篩選標(biāo)準(zhǔn),在871條差異表達中篩選出20個差異顯著表達的mi RNAs,其中15個差異miRNA表達上調(diào),5個差異miRNA表達下調(diào)。4.結(jié)合高通量測序結(jié)果及查閱相關(guān)文獻,在15個表達上調(diào)的mi RNA中挑選4個(hsa-miR-451a、hsa-miR-122-5P、hsa-miR-143-3P、hsa-miR-223-3P)和5個表達下調(diào)的miRNA中挑選1個(hsa-mi R-421)進行qRT-PCR驗證,結(jié)果顯示hsa-miR-451a、hsa-miR-122-5P、hsa-miR-143-3、hsa-miR-421表達量的變化趨勢與高通量測序的結(jié)果一致,在實驗組與對照組中差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),從而檢測高通量測序結(jié)果的準(zhǔn)確性;5.通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn),差異顯著的miRNA的靶基因主要富集蛋白結(jié)合,細(xì)胞代謝過程、運輸過程等條目;其中hsa-miR-143-5P、hsa-mi R-421與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。通過對hsa-miR-143-5P、hsa-miR-421進一步行信號通路分析發(fā)現(xiàn),hsa-miR-143--5P靶基因主要涉及到腫瘤蛋白多糖、p53信號通路、癌癥相關(guān)通路及MAPK信號通路等過程,其中在p53信號通路、MAPK信號通路達到顯著性富集水平(p0.01);而hsa-mi R-421靶基因主要涉及到腫瘤蛋白多糖、Rap1信號通路和Wnt信號通路等過程,其中在Wnt信號通路達到顯著性富集(p0.01)。結(jié)論:推測IKCa1可通過影響相關(guān)mi RNAs表達,進一步影響其靶基因在p53/MAPK/Wnt信號通路上的調(diào)控,從而對HeLa細(xì)胞增值、遷移及侵襲產(chǎn)生影響。抑制IKCa1可抑制HeLa細(xì)胞增值、遷移和侵襲。
【學(xué)位單位】：西南醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R737.33
【部分圖文】：

of HeLa cells（ x s）組別Hela 細(xì)胞遷移實際距離（μm）24h 48h 72hDMSO 組 170.05±0.74 227.78±5.37 290.80±0.78觀察 1 組 173.01±4.04 234.34±4.66 297.15±4.43觀察 2 組 128.09± 4.73* 187.16±4.96* 240.34±3.34*觀察 3 組 109.95±4.79* 165.90±11.37* 190.95±10.60*觀察 4 組 64.60±4.84* 105.48±4.53* 137.01±5.96*觀察 5 組 45.66±4.60* 64.10±5.73* 81.93±12.48*注：與 DMSO 組相比，*P<0.001。Note：compared with group DMSO，*P<0.001

表 6 各組 HeLa 細(xì)胞總 RNA OD260/280 及 6 Total RNAOD260/280 and concentrationOD260/280 濃度(ng/ul) 1 1.96 187.9 2 1.83 201.7 3 1.87 190.3 1 1.83 303.6 2 1.92 329.3 3 2.01 327.7

西 南 醫(yī) 科 大 學(xué) 碩 士 學(xué) 位 論 文法從上調(diào)差異顯著表達的 miRNAs 中選擇 4 個 miRNAs（hsa-miR-451a、sa-miR-122-5P、hsa-miR-143-3P、hsa-miR-223-3P）和下調(diào)差異顯著表達 miRNAs 中挑選一個（hsa-miR-421）進行驗證。實驗組與對照組中各測 miRNA 和內(nèi)參 U6 的溶解曲線及擴增曲線如圖 5A、5B 所示；溶解線僅出現(xiàn)一個單一峰，提示引物特異性好；說明所測的 Ct 值可應(yīng)用后檢測。而通過 RT-PCR 結(jié)果發(fā)現(xiàn) hsa-miR-451a、hsa-miR-122-5P、sa-miR-143-3、hsa-miR-421 表達量的變化趨勢與高通量測序的結(jié)果基本致（P＜0.05），進一步證實了高通量測序結(jié)果的準(zhǔn)確性，見圖 6。
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2 程慧;IKCa1相關(guān)的miRNA對HeLa細(xì)胞增殖、遷移及侵襲作用機制初探[D];西南醫(yī)科大學(xué);2018年

本文編號：2886500