目的:子宮頸癌是全球婦女發(fā)病率僅低于乳腺癌的第二個(gè)最常見(jiàn)的惡性腫瘤。宮頸癌的致病因素比較明確,人乳頭瘤病毒(human papillomavirus,HPV)感染已被確定是高危因素,尤以HPV16和18型最常見(jiàn)。HPV E6、E7癌基因整合到宿主細(xì)胞后,分別與p53和pRb結(jié)合,導(dǎo)致這兩種抑癌基因失活,改變了細(xì)胞生長(zhǎng)周期的調(diào)控機(jī)制,引起宿主細(xì)胞永生化,最終引起宮頸癌。研究發(fā)現(xiàn),Notch信號(hào)通路在維持細(xì)胞增殖、分化和凋亡之間的平衡起著至關(guān)重要的作用,與人類(lèi)惡性腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。數(shù)十年前在宮頸癌的相關(guān)研究中檢測(cè)到Notch1,提示其在宮頸癌中可能發(fā)揮作用。從宮頸癌前病變發(fā)展到浸潤(rùn)癌的過(guò)程中,Notch受體及其配體Jagged1蛋白水平升高。Notch1協(xié)同HPV E6和E7癌基因促進(jìn)宮頸鱗狀上皮細(xì)胞惡變。但是也有研究表明Notch1在宮頸癌中具有抑癌作用,其雙重作用可能與Notch1濃度和宮頸病變不同階段有關(guān)。Notch信號(hào)激活對(duì)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transition,EMT)的啟動(dòng)至關(guān)重要,EMT發(fā)生過(guò)程中上皮細(xì)胞經(jīng)過(guò)形態(tài)變化,轉(zhuǎn)化為間質(zhì)細(xì)胞,降低細(xì)胞間的黏附能力和增加其運(yùn)動(dòng)能力,使細(xì)胞遷移能力增加,抑制細(xì)胞凋亡并加強(qiáng)侵襲能力,與腫瘤的發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移關(guān)系密切。此外,Notch信號(hào)與其他信號(hào),如Wnt/β-catenin、TGF-β、PI3K/Akt通路存在交互作用,通過(guò)不同機(jī)制對(duì)Notch信號(hào)通路進(jìn)行調(diào)節(jié)。本研究將了解Notch信號(hào)通路在宮頸癌病變過(guò)程中可能發(fā)揮的作用,以及與HPV的相關(guān)性,旨在探討Notch信號(hào)通路與HPV感染在宮頸病變進(jìn)展中潛在的作用機(jī)制,并欲求尋找能阻斷抑制宿主細(xì)胞分化的關(guān)鍵分子,為探索宮頸癌防治新策略和新靶點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法:1建立人宮頸癌裸鼠移植瘤模型。體外培養(yǎng)HPV16陽(yáng)性的人宮頸癌細(xì)胞SiHa。擴(kuò)增并提取小干擾RNA(miRNA)質(zhì)粒,包括HPV16E6-miRNA、HPV16 E7-miRNA干擾質(zhì)粒和1個(gè)陰性對(duì)照Neg-miRNA空白質(zhì)粒。將SiHa細(xì)胞接種到BALB/c裸鼠右前腋窩中部外側(cè)皮下,待腫瘤體積約為80~120mm3,根據(jù)成瘤情況32只裸鼠隨機(jī)分為4組,包括2個(gè)對(duì)照組,即生理鹽水組(簡(jiǎn)稱(chēng)鹽水對(duì)照組)和空質(zhì)粒組(Neg-miRNA組),2個(gè)治療組,即HPV16 E6基因沉默組(HPV16E6-miRNA組)和HPV16E7基因沉默組(HPV16 E7-miRNA組)。利用體內(nèi)轉(zhuǎn)染方式,定期定量對(duì)4組裸鼠分別行瘤內(nèi)多點(diǎn)注射生理鹽水、Neg-miRNA、HPV16E6-miRNA、HPV16 E7-miRNA,每隔2天注射一次,共注射9次,每次注射前測(cè)量腫瘤體積,腫瘤生長(zhǎng)情況,最后一次給藥48小時(shí)后處死裸鼠,及時(shí)移植瘤取材,測(cè)量移植瘤體積徑和重量,分裝標(biāo)本。2取材后提取RNA,采用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測(cè)方法檢測(cè)SiHa細(xì)胞宮頸癌裸鼠移植瘤中目的基因的mRNA水平,包括Notch1、Jagged1、PI3K、p-AKT和NF-κB。3收集2014年3月至2015年12月在河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院因?qū)m頸病變行陰道鏡活檢或手術(shù)的宮頸組織,及時(shí)放入4%多聚甲醛固定,后放置4℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｆ渲袑m頸病變包括低度宮頸上皮內(nèi)瘤變(LSIL)16例和高度宮頸上皮內(nèi)瘤變(HSIL)27例,術(shù)前未進(jìn)行放化療的宮頸癌組織共21例,其中包括鱗狀細(xì)胞癌18例、腺癌3例,術(shù)前行新輔助化療的宮頸鱗癌5例、宮頸腺癌2例以及宮頸腺鱗癌1例,根據(jù)2009年FIGO分期包括IA期6例,IB期13例,IIA10例,同時(shí)期收集因子宮肌瘤或子宮腺肌癥行全子宮切除的宮頸標(biāo)本共10例作為對(duì)照組。所有病例均采用羅氏Cobas 4800 HPV檢測(cè)系統(tǒng),通過(guò)實(shí)時(shí)PCR對(duì)14種高危型HPV DNA進(jìn)行擴(kuò)增和檢測(cè),包括HPV16、18和其余12種亞型(31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66及68)。對(duì)照組術(shù)前TCT檢查除外宮頸病變,HPV檢測(cè)結(jié)果為陰性,術(shù)后病理顯示宮頸無(wú)異常。收集所有手術(shù)病人的基本信息、HPV結(jié)果和完整的病理結(jié)果。所取宮頸組織經(jīng)河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院倫理會(huì)批準(zhǔn)及患者和/或家屬知情同意。4人體宮頸組織標(biāo)本采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)目的基因的蛋白表達(dá)情況,包括Notch1、Jagged1、PI3K、p-AKT和NF-κB。分析Notch信號(hào)通路對(duì)EMT和宮頸癌發(fā)病過(guò)程的影響。結(jié)果:1成功建立裸鼠皮下移植瘤1.1裸鼠全部存活,成瘤潛伏期約為30天,肉眼可見(jiàn)明顯移植瘤,體積約80~120mm3,外形不規(guī)則,個(gè)別瘤體可出現(xiàn)潰破和出血,剝離瘤塊見(jiàn)瘤體質(zhì)硬,切面灰白色壞死灶,未見(jiàn)明顯血管生成,成瘤率為100%。1.2通過(guò)體內(nèi)轉(zhuǎn)染方式分別沉默HPV16 E6和E7基因,兩個(gè)治療組裸鼠移植瘤在小鼠被處死前的體積和腫瘤重量均小于兩個(gè)對(duì)照組,P0.05,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。1.3各組宮頸癌裸鼠移植瘤Notch1、Jagged1、PI3K、p-AKT和NF-κB的mRNA水平采用Real-Time PCR分別檢測(cè)4組移植瘤中目的基因的mRNA的表達(dá)水平。HPV16 E6基因沉默組和HPV16 E7基因沉默組分別與空質(zhì)粒組和鹽水對(duì)照組比較,Notch1、Jagged1、PI3K、p-AKT和NF-κB mRNA表達(dá)水平均降低,P0.05,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義�？召|(zhì)粒組與鹽水對(duì)照組比較,Notch1、Jagged1、PI3K、p-AKT和NF-κB mRNA的表達(dá)水平無(wú)差異,P0.05,無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說(shuō)明SiHa細(xì)胞宮頸癌移植瘤中的HPV16 E6/E7基因沉默后,Notch信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑受抑制。2人體宮頸組織標(biāo)本分析2.1高危型HPV(high-oncogenic risk HPV,hr-HPV)感染率hr-HPV感染檢出率隨著宮頸病變的進(jìn)展升高。正常對(duì)照組無(wú)hr-HPV感染;LSIL組織中hr-HPV陽(yáng)性率1.25%(2/16);HSIL組織中hr-HPV陽(yáng)性率88.89%(24/27);宮頸癌組織中hr-HPV陽(yáng)性率100%(29/29)。hr-HPV感染率以HPV16陽(yáng)性為主(45/55),其次為HPV18陽(yáng)性(4/55)。2.2 Notch信號(hào)通路Notch1、Jagged1、PI3K、p-AKT和NF-κB蛋白的表達(dá)在正常宮頸上皮和LSIL組織中,Notch1、Jagged1、PI3K、p-AKT、NF-κB蛋白表達(dá)均較弱;而HSIL組中,上述5種目的蛋白表達(dá)為陽(yáng)性;宮頸癌組織中,Notch1、Jagged1、PI3K、p-AKT、NF-κB蛋白表達(dá)強(qiáng)陽(yáng)性。Notch信號(hào)通路中Notch1、Jagged1、PI3K、p-AKT、NF-κB蛋白的表達(dá)在宮頸病變進(jìn)展過(guò)程中逐漸增多,LSIL上述5種目的基因的蛋白表達(dá)與宮頸癌比較,P0.05,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。術(shù)前進(jìn)行新輔助化療的宮頸鱗癌組織中上述蛋白表達(dá)較未行化療的宮頸鱗癌組織明顯減少,5種目的基因的蛋白表達(dá)比較,P0.05,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;而宮頸腺癌組織術(shù)前化療與未化療比較,上述蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化,但因樣本例數(shù)小(2例),無(wú)法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。認(rèn)為術(shù)前行新輔助化療可以降低宮頸鱗癌組織Notch信號(hào)通路中Notch1、Jagged1、PI3K、p-AKT、NF-κB蛋白的表達(dá),而對(duì)宮頸腺癌組織中目的蛋白表可能無(wú)明顯影響。結(jié)論:1成功建立了SiHa細(xì)胞宮頸鱗癌裸鼠皮下移植瘤模型,并利用RNA干擾技術(shù)證明HPV16 E6-miRNA和HPV16 E7-miRNA能夠有效抑制移植瘤生長(zhǎng),RNA干擾技術(shù)可用于宮頸癌的體內(nèi)研究;2沉默HPV16 E6/E7基因抑制小鼠移植瘤生長(zhǎng)的效應(yīng),可能通過(guò)下調(diào)Notch信號(hào)通路的主要基因Notch1、Jagged1、PI3K、p-AKT、NF-κB而發(fā)揮作用;3 Notch信號(hào)通路中主要基因Notch1、Jagged1、PI3K、p-AKT、NF-κB蛋白的表達(dá)隨宮頸病變進(jìn)展而逐漸增多,Notch信號(hào)通路參與宮頸癌發(fā)生;4術(shù)前行新輔助化療可以降低宮頸鱗癌組織Notch信號(hào)通路中Notch1、Jagged1、PI3K、p-AKT、NF-κB蛋白的表達(dá),而對(duì)宮頸腺癌組織中目的蛋白表可能無(wú)明顯影響。
【學(xué)位單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2016
【中圖分類(lèi)】：R737.33
【部分圖文】：
圖 1 Notch1 和 Jagged1mRNA 表達(dá)情況Fig.1 Expression of Notch1 and Jagged1 mRNA注：與空質(zhì)粒組和鹽水對(duì)照組比較，HPV16 E6 和 E7 基因沉默組中Notch1 和 Jagged1mRNA 表達(dá)水平均降低(P＜0.05)Note: Down-regulate expression of Notch1 and Jagged1 mRNArespectively in HPV16 E6-miRNA group and HPV16 E7-miRNA groupcompare to the Neg-miRNA and blank groups(P＜0.05)
圖 2 PI3K、p-AKT and NF-κB mRNA 表達(dá)情況Fig.2 Expression of PI3K, p-AKT and NF-κB mRNA注：與空質(zhì)粒組和鹽水對(duì)照組比較，HPV16 E6 和 E7 基因沉默中 PI3p-AKT and NF-κB mRNA 表達(dá)水平均降低 (P＜0.05)Note: Down-regulate expression of PI3K, p-AKT and NF-κB mRrespectively in HPV16 E6-miRNA group and HPV16 E7-miRNA gcompare to the Neg-miRNA and blank groups(P＜0.05)
圖 3 免疫組化結(jié)果顯示 Notch1 蛋白在人宮頸組織的表達(dá)情況Fig.3 Immunohistochemical expression of Notch1 on human cervicalsamples注：LSIL 和 HSIL 的鑲嵌部分表示正常宮頸組織，宮頸鱗癌和宮頸腺癌組左上角鑲嵌部分表示術(shù)前行輔助化療組織（400×）。可見(jiàn) LSIL病變中 Notch1 蛋白表達(dá)弱陽(yáng)性，與正常對(duì)照比較并無(wú)明顯差異；HSIL病變中 Notch1 蛋白表達(dá)陽(yáng)性，明顯高于正常對(duì)照組；Notch1 蛋白鱗癌中表達(dá)高于化療后組織，但是在腺癌中卻未見(jiàn)明顯變化Note: The upper insets represent normal samples in LSIL and HSILgroups and represent cancer tissue with NAC in SCC and AC groupsrespectively (400×).The expression of Notch1 in LSIL is weakly positiveand has no significant difference compared with normal tissues, but inHSIL Notch1 expression is significantly higher than that in normal group;
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本文編號(hào)：
2891050
