耐藥卵巢癌細(xì)胞的體外篩選及核酸適配體的初步應(yīng)用
發(fā)布時間：2020-12-04 00:58
核酸適配體（aptamer）是通過體外篩選技術(shù),即指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)（Systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX）得到的單鏈DNA或RNA。核酸適配體被稱為“化學(xué)抗體”,有著與蛋白抗體相同的識別機(jī)制,并且,較蛋白抗體具有一定的優(yōu)勢:可直接通過化學(xué)合成并能根據(jù)要求對其修飾;親和力高,結(jié)合解離常數(shù)甚至可達(dá)到納摩爾級;結(jié)構(gòu)穩(wěn)定,便于保存等。利用活的腫瘤細(xì)胞為靶標(biāo)的cell-SELEX技術(shù),能夠在靶標(biāo)分子未知的前提下,篩選得到識別腫瘤細(xì)胞的核酸適配體,直接用于腫瘤的診斷及治療。本論文利用cell-SELEX技術(shù)篩選靶向腫瘤細(xì)胞的核酸適配體,對核酸適配體進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析和性質(zhì)表征,并嘗試?yán)眠@些核酸適配體開發(fā)腫瘤的診斷和治療新方法,具體研究如下:耐藥型的卵巢癌細(xì)胞的篩選及表征:以紫杉醇耐受的卵巢癌細(xì)胞A2780T作為篩選的靶細(xì)胞,野生型卵巢癌細(xì)胞A2780作為反篩細(xì)胞,篩選出選擇性識別A2780T細(xì)胞的核酸適配體HF3和HA5。對其進(jìn)行序列優(yōu)化及表征,得到具有高親和力的核酸適配體HF3-58和HA5-68,進(jìn)...
【文章來源】：湘潭大學(xué)湖南省
【文章頁數(shù)】：63 頁
【學(xué)位級別】：碩士
【部分圖文】：
SELEX基本篩選過程[9]
?＼?ｌａｓ：?ＳＥＬＥＸ??＼一?．★＊．??Ｃｌｏｎｉｎｇ?ａｎｄ?ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ??圖１．１?ＳＥＬＥＸ基本篩選過程［９］??１．３．２?ＳＥＬＥＸ技術(shù)的分類??１．３．２．１傳統(tǒng)篩選方法??利用傳統(tǒng)的ＳＥＬＥＸ技術(shù)，篩選得到核酸適配體需要幾周甚至是一個月的時??間［９］，基本原理見圖１．２。通過化學(xué)合成的寡核苷酸文庫用于核酸適配體的篩選，??此文庫中的寡核苷酸一般由中間隨機(jī)序列和兩端固定的引物序列構(gòu)成。傳統(tǒng)的??ＳＥＬＥＸ篩選方法中的篩選步驟取決于篩選的核酸適配體的類型。對于ＤＮＡ型的??核酸適配體，通過化學(xué)合成的ＤＮＡ文庫直接與靶標(biāo)分子孵育，然后將與靶標(biāo)分??子不結(jié)合的序列洗掉，再分離靶分子與結(jié)合的ＤＮＡ，經(jīng)過ＰＣＲ將分離出的結(jié)合??的ＤＮＡ序列進(jìn)行擴(kuò)增再進(jìn)行下一輪的篩選。通過一系列篩選得到潛在的核酸適??配體，進(jìn)一步通過多種研究方法確定其序列及其動力學(xué)。對于ＲＮＡ型的核酸適??配體，增加了體外轉(zhuǎn)錄和反轉(zhuǎn)錄的步驟，將一個ＤＮＡ文庫先要轉(zhuǎn)錄成ＲＮＡ文??庫，篩選過程與ＤＮＡ型的一致，結(jié)合后的ＲＮＡ序列分離出來之后將其反轉(zhuǎn)錄??成ＤＮＡ序列
圖１．３毛細(xì)管電泳ＳＥＬＥＸ技術(shù)示意圖［９］??１．３．２．３基于磁珠的ＳＥＬＥＸ技術(shù)??利用磁珠固定靶分子的ＳＥＬＥＸ技術(shù)（圖１．４）在１９９７年被提出。該方法是??將靶分子固定在磁珠上與寡核苷酸的文庫進(jìn)行孵育，通過磁力分離器將靶蛋白與??核酸適配體的結(jié)合混合物從不結(jié)合的寡核苷酸分離出來，然后通過熒光顯微鏡定??性與靶蛋白結(jié)合的核酸適配體，利用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行定量。２００５年一種更方便??更容易的ＦｌｕＭａｇ－ＳＥＬＥＸ［３８］方法被提出，ｎｕＭａｇ?ＳＥＬＥＸ技術(shù)的原理是基于目標(biāo)??磁珠固定化：第一輪選拔后，單鏈ＤＮＡ進(jìn)行ＰＣＲ擴(kuò)增并標(biāo)記熒光素修飾引物??量化下一步的篩選的核酸適配體；然后將獲得的寡核苷酸克隆并測序。富集后的??核酸適配體的解離常數(shù)可以通過熒光測定。使用此方法得到了鏈和青霉素［３８］，異??丁苯丙酸［３９］和多氯聯(lián)苯＿的核酸適配體。Ｃａｐｔｕｒｅ－ＳＥＬＥＸ是Ｓｔｏｌｔｅｎｂｕｒｇ等人在??２０１２年提出的基于ＦｌｕＭａｇ?ＳＥＬＥＸ的新方法。其區(qū)別在于將固定靶分子替代為??磁珠固定篩選ＤＮＡ文庫，這樣的修改是針對篩選不能被固定的小分子，如同??ＦｌｕＭａｇＳＥＬＥＸ篩選一樣每輪篩選后進(jìn)行熒光標(biāo)記使得可通過熒光定量�；谠�??方法篩選得到的核酸適配體的靶分子有卡那霉素
本文編號：2896754
【文章來源】：湘潭大學(xué)湖南省
【文章頁數(shù)】：63 頁
【學(xué)位級別】：碩士
【部分圖文】：
SELEX基本篩選過程[9]
?＼?ｌａｓ：?ＳＥＬＥＸ??＼一?．★＊．??Ｃｌｏｎｉｎｇ?ａｎｄ?ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ??圖１．１?ＳＥＬＥＸ基本篩選過程［９］??１．３．２?ＳＥＬＥＸ技術(shù)的分類??１．３．２．１傳統(tǒng)篩選方法??利用傳統(tǒng)的ＳＥＬＥＸ技術(shù)，篩選得到核酸適配體需要幾周甚至是一個月的時??間［９］，基本原理見圖１．２。通過化學(xué)合成的寡核苷酸文庫用于核酸適配體的篩選，??此文庫中的寡核苷酸一般由中間隨機(jī)序列和兩端固定的引物序列構(gòu)成。傳統(tǒng)的??ＳＥＬＥＸ篩選方法中的篩選步驟取決于篩選的核酸適配體的類型。對于ＤＮＡ型的??核酸適配體，通過化學(xué)合成的ＤＮＡ文庫直接與靶標(biāo)分子孵育，然后將與靶標(biāo)分??子不結(jié)合的序列洗掉，再分離靶分子與結(jié)合的ＤＮＡ，經(jīng)過ＰＣＲ將分離出的結(jié)合??的ＤＮＡ序列進(jìn)行擴(kuò)增再進(jìn)行下一輪的篩選。通過一系列篩選得到潛在的核酸適??配體，進(jìn)一步通過多種研究方法確定其序列及其動力學(xué)。對于ＲＮＡ型的核酸適??配體，增加了體外轉(zhuǎn)錄和反轉(zhuǎn)錄的步驟，將一個ＤＮＡ文庫先要轉(zhuǎn)錄成ＲＮＡ文??庫，篩選過程與ＤＮＡ型的一致，結(jié)合后的ＲＮＡ序列分離出來之后將其反轉(zhuǎn)錄??成ＤＮＡ序列
圖１．３毛細(xì)管電泳ＳＥＬＥＸ技術(shù)示意圖［９］??１．３．２．３基于磁珠的ＳＥＬＥＸ技術(shù)??利用磁珠固定靶分子的ＳＥＬＥＸ技術(shù)（圖１．４）在１９９７年被提出。該方法是??將靶分子固定在磁珠上與寡核苷酸的文庫進(jìn)行孵育，通過磁力分離器將靶蛋白與??核酸適配體的結(jié)合混合物從不結(jié)合的寡核苷酸分離出來，然后通過熒光顯微鏡定??性與靶蛋白結(jié)合的核酸適配體，利用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行定量。２００５年一種更方便??更容易的ＦｌｕＭａｇ－ＳＥＬＥＸ［３８］方法被提出，ｎｕＭａｇ?ＳＥＬＥＸ技術(shù)的原理是基于目標(biāo)??磁珠固定化：第一輪選拔后，單鏈ＤＮＡ進(jìn)行ＰＣＲ擴(kuò)增并標(biāo)記熒光素修飾引物??量化下一步的篩選的核酸適配體；然后將獲得的寡核苷酸克隆并測序。富集后的??核酸適配體的解離常數(shù)可以通過熒光測定。使用此方法得到了鏈和青霉素［３８］，異??丁苯丙酸［３９］和多氯聯(lián)苯＿的核酸適配體。Ｃａｐｔｕｒｅ－ＳＥＬＥＸ是Ｓｔｏｌｔｅｎｂｕｒｇ等人在??２０１２年提出的基于ＦｌｕＭａｇ?ＳＥＬＥＸ的新方法。其區(qū)別在于將固定靶分子替代為??磁珠固定篩選ＤＮＡ文庫，這樣的修改是針對篩選不能被固定的小分子，如同??ＦｌｕＭａｇＳＥＬＥＸ篩選一樣每輪篩選后進(jìn)行熒光標(biāo)記使得可通過熒光定量�；谠�??方法篩選得到的核酸適配體的靶分子有卡那霉素
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