背景:慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary disease,COPD)是持續(xù)性氣流受限為特征的疾病,是全球重要的公共健康問(wèn)題。在我國(guó)患病率高,60歲以上人群患病率高達(dá)13~30%,隨著老齡化社會(huì)的來(lái)臨,發(fā)病率還將持續(xù)上升。COPD患者存在臨床表現(xiàn)不一、疾病嚴(yán)重性與肺功能的嚴(yán)重程度不完全匹配、病情進(jìn)行性加重遷延不愈、易并發(fā)多種肺內(nèi)肺外并發(fā)癥等問(wèn)題,嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量及生存時(shí)間。而目前的治療手段尚不能阻止肺功能的進(jìn)行性下降,迫切需要開(kāi)發(fā)新的治療措施延緩疾病的進(jìn)展。篩選與疾病分級(jí)(嚴(yán)重程度)相關(guān)的生物學(xué)標(biāo)志物及治療靶點(diǎn)對(duì)COPD患者定制個(gè)體化治療方案有重要指導(dǎo)作用。COPD是環(huán)境因素與宿主基因相互作用的多因素疾病,發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,疾病緩慢進(jìn)行性發(fā)展。目前普遍認(rèn)為COPD與單核/巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞引起的炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)以及蛋白酶與抗蛋白酶失衡等有關(guān),而近年來(lái)遺傳易感性在COPD中的作用逐漸受到關(guān)注。miRNA是具有調(diào)控功能的非編碼RNA,參與調(diào)節(jié)許多重要的生物過(guò)程如:生長(zhǎng)發(fā)育、細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化、凋亡等,與肺部多種疾病的發(fā)生發(fā)展有密切的聯(lián)系,參與了多種肺部疾病的發(fā)病機(jī)制。由于mi RNA的穩(wěn)定性好,在血液中易于檢測(cè),并具有特異性強(qiáng)、靈敏度高等特點(diǎn),有可能成為COPD新型的分子標(biāo)志物。因此尋找與COPD分級(jí)(嚴(yán)重程度)相關(guān)的miRNA,可為治療提供新靶點(diǎn)。進(jìn)而對(duì)于參與疾病生物過(guò)程的miRNA進(jìn)行功能分析,為COPD發(fā)病機(jī)制的研究提供新的方向,及未來(lái)定制個(gè)體化治療方案提供理論基礎(chǔ)。研究目的:1.采用小RNA高通量技術(shù),篩選與COPD分級(jí)(嚴(yán)重程度)相關(guān)的差異表達(dá)miRNAs,驗(yàn)證其可否成為生物學(xué)標(biāo)志物及治療的候選靶點(diǎn)。2.在體外細(xì)胞水平闡明候選mi RNA在COPD生物過(guò)程中的功能,及其對(duì)靶基因的調(diào)控機(jī)制,探索mi RNA在其發(fā)病機(jī)制中的作用,為COPD的治療提供新靶點(diǎn)。研究方法:1.按照2013年gold(globalinitiativeforchronicobstructivelungdisease)指南,選取山西大醫(yī)院呼吸科門(mén)診2014年1月至2014年12月診斷明確的copd穩(wěn)定期患者141例,進(jìn)行綜合評(píng)估分組。根據(jù)入選排除標(biāo)準(zhǔn)最終納入本研究copd患者共20例,abcd組每組5例。健康對(duì)照組6例。所有參與者抽取外周血,分離白細(xì)胞,提取總rna,進(jìn)行小rna高通量測(cè)序,運(yùn)用生物信息學(xué)分析篩選copd各組間及臨床疾病發(fā)展模式中存在的差異性顯著性mirna、并進(jìn)行g(shù)o和kegg通路分析。候選的mirna采用實(shí)時(shí)熒光定量pcr法在本地?cái)U(kuò)大樣本的copd患者80例中進(jìn)行驗(yàn)證。2.在體外通過(guò)rt-pcr檢測(cè)篩選驗(yàn)證的mirnas在人單核thp-1細(xì)胞中表達(dá)量。構(gòu)建慢病毒感染細(xì)胞,mts活力檢測(cè)進(jìn)行mirnas細(xì)胞功能的篩選。通過(guò)細(xì)胞功能學(xué)實(shí)驗(yàn)(cck-8、pi-facs細(xì)胞周期、annexinv-apc細(xì)胞凋亡檢測(cè))進(jìn)一步明確mirnas在copd的功能。運(yùn)用熒光素酶lucifersae檢測(cè)確定靶向mirna及其靶向基因間是否存在直接調(diào)控的作用。結(jié)果:1.(1)與健康對(duì)照組相比,在copd患者中有1715種表達(dá)差異顯著的mirnas,包括51種上調(diào)的mirnas,18種下調(diào)的mirnas。(2)在copdabcd各組中19種mirnas共同呈現(xiàn)差異表達(dá)顯著,17種mirnas在各組中共同上調(diào)。其中mir-106b-5p在a組中表達(dá)水平最高,在d組表達(dá)水平最低(abcd),而mir-125a-5p在copd組中表達(dá)水平明顯增高,其中在abc組中其表達(dá)量逐漸下降,但在d組其表達(dá)量出現(xiàn)轉(zhuǎn)折性增高。(3)在臨床疾病發(fā)展模式中從a組到b組到d組mir-183-5p的表達(dá)水平持續(xù)下調(diào)。(4)go分析顯示大部分的基因功能注釋集中在copd生物學(xué)過(guò)程,如細(xì)胞周期、凋亡、代謝、粘附等,部分基因涉及代謝、免疫、應(yīng)激、細(xì)胞信號(hào)等。(5)kegg通路分析顯示mirna相關(guān)靶基因與copd的許多重要信號(hào)通路及合并癥相關(guān),如細(xì)胞自噬的調(diào)節(jié),粘著斑,toll-like受體信號(hào)通路,癌癥相關(guān)通路,非小細(xì)胞癌,erbb信號(hào)通路及p53信號(hào)通路等。(6)候選出的mir-106b-5p、mir-125a-5p在本地copd樣本中進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量pcr驗(yàn)證,與測(cè)序結(jié)果一致。2.(1)miR-106b-5p、miR-125a-5p在THP-1細(xì)胞中為低表達(dá)。(2)成功構(gòu)建過(guò)表達(dá)mir慢病毒感染細(xì)胞,qPCR檢測(cè)過(guò)表達(dá)基因發(fā)現(xiàn)miR-106b-5p表達(dá)豐度是對(duì)照組NC的7.636倍,miR-125a-5p表達(dá)豐度是對(duì)照組NC的59621.539倍。(3)MTS活力檢測(cè)結(jié)果表明:與對(duì)照組NC相比,hsa-miR-125a-5p組的細(xì)胞增殖倍數(shù)發(fā)生了顯著的變化(P0.05),而hsa-miR-106b-5p的細(xì)胞增殖變化則不明顯。(4)CCK-8細(xì)胞毒性檢測(cè)表明:相比對(duì)照組NC,mir-125a-5p組在5天時(shí)的吸收率變化倍數(shù)有顯著變化。(5)通過(guò)PI-FACS細(xì)胞周期檢測(cè)提示miR-125a-5p-UP組處于S期的細(xì)胞數(shù)減少(P0.05),G2/M期的細(xì)胞數(shù)增多(P0.05),使細(xì)胞從S期到G2/M期進(jìn)程加速,促進(jìn)了細(xì)胞的增殖。(6)通過(guò)Annexin V-APC細(xì)胞凋亡檢測(cè),相比對(duì)照組,mir-125a-5p組凋亡細(xì)胞數(shù)無(wú)顯著差異(P0.05)。(7)Luciferase檢測(cè)分析miRNA-125a-5p與靶基因IL16的3'UTR結(jié)合,抑制靶基因IL16的表達(dá),miR-125a和其靶基因IL16存在直接調(diào)控關(guān)系。結(jié)論:1.miR-106b-5p,miR-125a-5p及miR-183-5p在COPD的發(fā)生發(fā)展中起重要作用,尤其miR-125a-5p和miR-106b-5p與COPD的疾病嚴(yán)重程度相關(guān)。2.miR-125a-5p在人THP-1單核細(xì)胞系中功能明顯,可促進(jìn)單核巨噬系統(tǒng)的增殖,調(diào)控靶基因IL-16表達(dá)下調(diào),通過(guò)增強(qiáng)抗炎作用成為COPD的保護(hù)因子。3.miR-125a-5p可能成為COPD分級(jí)(嚴(yán)重程度)標(biāo)志物及治療的新靶點(diǎn)。
【學(xué)位單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2017
【中圖分類(lèi)】：R563.9
【文章目錄】：中文摘要
英文摘要
縮略詞表
前言
第一部分 COPD患者中miRNA分級(jí)標(biāo)志物的篩選、驗(yàn)證及GO、KEGG通路分析
1 實(shí)驗(yàn)材料與方法
1.1 實(shí)驗(yàn)材料
1.2 實(shí)驗(yàn)方法
1.3 統(tǒng)計(jì)分析
2 結(jié)果
2.1 患者樣本的選擇
2.2 患者樣本的miRNA提取及質(zhì)量鑒定
2.3 測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量及長(zhǎng)度分析
2.4 miRNA的差異分析
2.5 miRNA表達(dá)譜GO富集分析
2.6 KEGG通路分析
2.7 qRT-PCR驗(yàn)證
3 討論
3.1 miRNA的表達(dá)差異分析
3.2 miRNA表達(dá)譜GO富集分析
3.3 miRNA表達(dá)譜的KEGG通路分析
4 結(jié)論
第二部分 候選microRNAs的功能分析
1 實(shí)驗(yàn)材料與方法
1.1 實(shí)驗(yàn)材料
1.2 實(shí)驗(yàn)方法
2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
2.1 miRNA表達(dá)量的細(xì)胞水平驗(yàn)證
2.2 慢病毒感染細(xì)胞
2.3 qPCR檢測(cè)過(guò)表達(dá)基因
2.4 MTS細(xì)胞活力檢測(cè)
2.5 CCK-8 細(xì)胞活力檢測(cè)
2.6 PI-FACS細(xì)胞周期檢測(cè)
2.7 Annexin V-APC細(xì)胞凋亡檢測(cè)
2.8 Luciferase檢測(cè)
3 討論
4 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
綜述
參考文獻(xiàn)
附錄
致謝
在學(xué)期間參與的科研課題與研究成果
個(gè)人簡(jiǎn)歷
【相似文獻(xiàn)】
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