發(fā)布時(shí)間：2020-11-22 02:17

　　 矽肺(silicosis)是由于長(zhǎng)期吸入大量游離二氧化硅(SiO2)粉塵引起的以肺間質(zhì)纖維化為主的全身性疾病,在我國(guó)是危害最嚴(yán)重的職業(yè)病之一。在我國(guó)平均每例塵肺病人每年經(jīng)濟(jì)損失約為3.41萬(wàn)元,每年僅因塵肺病造成的直接經(jīng)濟(jì)損失達(dá)140多億元,每年新增塵肺病例造成的經(jīng)濟(jì)損失達(dá)6億元。近年來(lái)矽肺病的流行呈現(xiàn)出群發(fā)性、低齡化以及致殘率高的新特點(diǎn),這給矽肺的防治工作帶來(lái)了新的挑戰(zhàn)。目前已發(fā)現(xiàn)許多對(duì)矽肺的診斷有價(jià)值的血清生物標(biāo)志物,如肺特異性的克拉拉細(xì)胞蛋白(CC16)、肺表面活性物質(zhì)D(SP-D)作為診斷指標(biāo)仍存在敏感性、特異性不足的缺點(diǎn),不同類(lèi)型的肺間質(zhì)病之間這些指標(biāo)重疊較大;而支氣管肺泡灌洗液的化學(xué)及細(xì)胞學(xué)檢查僅能作為影像學(xué)診斷的補(bǔ)充。運(yùn)用新技術(shù)手段篩選高特異性、敏感性的標(biāo)志物將對(duì)矽肺的早期防治起到重要的推動(dòng)。液體芯片飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)是一種基于磁珠分選與基質(zhì)輔助激光解吸離子化飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)聯(lián)合應(yīng)用的蛋白質(zhì)鑒定技術(shù),可直接檢測(cè)臨床未經(jīng)特殊處理的血清、尿液、腦脊液或漿膜腔積液等標(biāo)本,對(duì)疾病(特別是腫瘤)的診斷有較高的敏感性和特異性。本研究采用液體芯片飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)檢測(cè)矽塵暴露人群血清蛋白的表達(dá),篩選出矽肺發(fā)病早期的生物標(biāo)志物建立矽肺早期診斷的人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)診斷模型并對(duì)鑒定出的標(biāo)志物進(jìn)行相關(guān)功能的初步研究。 研究目的 應(yīng)用液體芯片飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)篩選矽塵暴露人群早期診斷血清生物標(biāo)志物,并對(duì)鑒定出的生物標(biāo)志物進(jìn)行初步功能研究。 研究方法 矽塵暴露人群85例為山西省陽(yáng)泉市某耐火材料廠接觸游離二氧化硅粉塵的工人,統(tǒng)一攝高千伏X射線后前位胸片(120-150KV、100mA、0.03-0.05s),由具有診斷資格的診斷專(zhuān)家組按照《塵肺病診斷標(biāo)準(zhǔn)GBZ70-2002》進(jìn)行診斷,分為矽塵暴露組(無(wú)塵肺0期)、可疑矽肺組(無(wú)塵肺0+期)和I期矽肺組;30例非暴露正常對(duì)照組為某單位年度體檢人員,均無(wú)矽塵暴露史。 本研究首先應(yīng)用invitrogen公司生產(chǎn)的Dynabeads RPC18磁珠,對(duì)矽塵暴露人群和非暴露正常對(duì)照組的血清進(jìn)行蛋白質(zhì)(多肽)的分選,然后對(duì)分選后的蛋白(多肽)采用MALDI-TOF-MS的一級(jí)質(zhì)譜技術(shù)和ClinProTools分析軟件進(jìn)行差異蛋白峰的篩選,同時(shí)應(yīng)用Matlab分析軟件建立人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)診斷模型,最后對(duì)篩選出的差異蛋白質(zhì)峰采用MALDI-TOF-MS二級(jí)質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行氨基酸序列鑒定。 按照二級(jí)質(zhì)譜鑒定出來(lái)的氨基酸序列人工合成差異蛋白,并用不同濃度的蛋白溶液作為刺激物,觀察其對(duì)矽肺形成過(guò)程中的靶細(xì)胞人胚肺成纖維細(xì)胞(MRC-5)的影響。 研究結(jié)果 1.一級(jí)質(zhì)譜尋找差異顯著峰結(jié)果:利用神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法(SNN)建立模型進(jìn)行各組間兩兩比較,發(fā)現(xiàn)0期與0+期、0期與I期、0+期與I期比較,其識(shí)別率分別為64.35%、84.38%和73.49%,其交叉驗(yàn)證能力分別為63.14%、52.82%和69.07%;而正常對(duì)照組(control)與0期、正常對(duì)照組與0+期、正常對(duì)照組與I期比較,其識(shí)別率分別為89.23%、98.52%和98.96%交叉驗(yàn)證能力分別為87.66%、94.20%和85.53%。 由上可知,0期與0+期、0期與I期、0+期與I期比較,其識(shí)別率和交叉驗(yàn)證能力都較差;而正常對(duì)照組(control)與0期、正常對(duì)照組與0+期、正常對(duì)照組與I期比較,其識(shí)別率和交叉驗(yàn)證能力都較好。因此,僅對(duì)0期、0+期、I期與正常對(duì)照組的差異顯著峰進(jìn)行提取,共得到5個(gè)差異峰(P0.01),其中5081Da和5066Da為表達(dá)上調(diào)的蛋白峰,2021da、3954da和1777da為表達(dá)下調(diào)的蛋白峰。 2.二級(jí)質(zhì)譜鑒定差異顯著峰氨基酸序列結(jié)果:根據(jù)二級(jí)質(zhì)譜儀器要求,選擇分子量3KDa的峰2021Da和1777Da進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜鑒定其氨基酸序列結(jié)果兩蛋白質(zhì)峰同為補(bǔ)體C3的一個(gè)片段C3f。 3.矽塵暴露人群接塵量與差異峰強(qiáng)度相關(guān)性分析:接塵量與5081Da、5066Da、3954Da、2021Da和1777Da 5個(gè)差異顯著峰的峰強(qiáng)的相關(guān)系數(shù)依次為r5081=0.039(P=0.614)、r5066=0.104(P=0.180)、r3954=-0.047(P=0.543)、r2021=-0.028(P=0.714)、r1777=-0.016 (P=0.853),5個(gè)差異蛋白峰強(qiáng)度與接塵量均不存在相關(guān)性。 4.矽塵暴露人群人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)診斷模型的建立:篩選出峰效果較好的2021Da、2554Da、5066Da、8600Da 4個(gè)P0.001的共同差異蛋白質(zhì)峰建立矽塵暴露人群診斷模型,其區(qū)分矽塵暴露人群與正常對(duì)照組的特異性為100%,敏感性為90%,準(zhǔn)確率為92.3%;該模型診斷0期、0+期和I期的識(shí)別率分別為100%、93%和96%。 5.不同濃度C3f刺激對(duì)MRC-5細(xì)胞上清液中Ⅰ、Ⅲ型膠原及TGF-β_1表達(dá)量變化的影響:隨著C3f濃度的增加,Ⅰ、Ⅲ型膠原及TGF-β_1的表達(dá)量均呈進(jìn)行性降低。與對(duì)照組相比,各濃度點(diǎn)均有顯著差異(P0.05)。 6.不同濃度C3f刺激對(duì)MRC-5胞質(zhì)中TGF-β_1表達(dá)量變化的影響:隨著C3f濃度的增加,MRC-5胞質(zhì)中TGF-β_1的積分光密度值呈進(jìn)行性降低,各濃度點(diǎn)均有顯著差異(P0.05) 研究結(jié)論 1.運(yùn)用液體芯片飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)的一級(jí)質(zhì)譜尋找矽塵暴露人群差異蛋白,并成功建立了矽塵暴露人群人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)診斷模型。 2.運(yùn)用液體飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)的二級(jí)質(zhì)譜技術(shù)鑒定出1777Da和2021Da同為C3f,后續(xù)的細(xì)胞功能研究證明C3f能夠減少M(fèi)RC-5細(xì)胞中Ⅰ、Ⅲ型膠原和TGF-β_1的形成。 綜上所述,本研究成功建立的矽塵暴露人群人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)診斷模型為矽肺的早期診斷提供了一種全新而有效的方法,后續(xù)對(duì)差異蛋白C3f功能的初步研究結(jié)果也為進(jìn)一步探討矽肺發(fā)病的免疫機(jī)制提供了研究線索。
【學(xué)位單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2010
【中圖分類(lèi)】：R135.2
【部分圖文】：

以及間質(zhì)細(xì)胞中膠原和其他細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)度沉積。其中 AMs 為纖維生成的中樞細(xì)胞，并參與細(xì)胞因子的生成和氧化性物質(zhì)的產(chǎn)生[3]。此外，多種免疫細(xì)胞包括中性粒細(xì)胞、T 淋巴細(xì)胞、肥大細(xì)胞也可積聚于肺間質(zhì)，參與纖維形成過(guò)程[4-6]。這些效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞（包括肺巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、支氣管上皮細(xì)胞和肺泡上皮細(xì)胞）之間復(fù)雜的相互作用為矽肺纖維化發(fā)展和病理過(guò)程的細(xì)胞因子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。SiO2顆粒進(jìn)入肺組織后與細(xì)胞外物質(zhì)反應(yīng)，刺激巨噬細(xì)胞對(duì)其進(jìn)行吞噬清除。此時(shí)，在細(xì)胞水平上巨噬細(xì)胞已被活化，在分子水平轉(zhuǎn)錄因子活化并且釋放 ROS 和 RNS，趨化因子，溶酶體酶，細(xì)胞因子，和生長(zhǎng)因子，最終細(xì)胞死亡（壞死／凋亡），釋放顆粒。巨噬細(xì)胞受損后，釋放的多種細(xì)胞因子參與刺激成纖維細(xì)胞增生和膠原的合成，并能啟動(dòng)免疫系統(tǒng)多種細(xì)胞產(chǎn)生效應(yīng)。同時(shí)，肺泡Ⅰ型上皮細(xì)胞在 SiO2顆粒的作用下，變性腫脹、崩解脫落；當(dāng)肺泡Ⅱ上皮細(xì)胞不能及時(shí)補(bǔ)修時(shí)，基底膜受損松解、暴露間質(zhì)，也可以刺激成纖維細(xì)胞增生。如圖 1 所示。

-21777DaMascot搜索結(jié)果

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【參考文獻(xiàn)】

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1 向陽(yáng);加藤智啟;;補(bǔ)體片段C3f、DRC3f對(duì)皮膚成纖維細(xì)胞合成和分泌轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1的調(diào)節(jié)作用[J];湖北民族學(xué)院學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2007年01期

2 韓明勇;劉奇;余捷凱;鄭樹(shù);;血清蛋白質(zhì)指紋圖譜與人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型在肺癌診斷中的應(yīng)用[J];山東大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2008年06期

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本文編號(hào)：2893951