發(fā)布時間：2020-11-21 10:58

　　 【研究背景】慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)是一種以氣流受限為主要特征的,可以預防,可以治療的疾病。COPD的氣流受限具有不完全可逆,呈進行性發(fā)展的特點。COPD患病人數(shù)多,在世界范圍內均有較高的死亡率,造成了嚴重的社會和經濟負擔,是全球性的公共健康難題。目前的研究結果表明,慢性煙草煙霧暴露可引發(fā)氣道以及肺部的異常炎癥反應,使中性粒細胞、巨噬細胞等炎癥細胞發(fā)生活化,導致體內活性氧簇產生增多,DNA雙鏈發(fā)生斷裂,引起DNA損傷反應,致使肺組織細胞出現(xiàn)衰老改變。同時,慢性煙草煙霧暴露可促使炎癥細胞釋放TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8等細胞炎癥因子,促使更多中性粒細胞、巨噬細胞等炎癥細胞浸潤肺部。上述炎癥細胞在胞吞煙草煙霧等異物后,可分泌更多的促炎因子,后者在活性氧簇以及異物表面抗原分子的刺激下,介導固有免疫應答及適應性免疫應答,進而再次加重肺部的炎癥反應。慢性煙草煙霧暴露是COPD發(fā)生發(fā)展的高危因素,其致病作用已引起臨床醫(yī)師及研究學者的高度關注。長鏈非編碼RNA(Long non-coding RNAs,lnc RNAs)是一類長度大于200個核苷酸的RNA分子,約占非編碼RNA的80%,主要由RNA聚合酶Ⅱ轉錄生成。lnc RNAs可在表觀遺傳學、轉錄、轉錄后等多個層面影響并調控機體中蛋白編碼基因的表達。近年來,隨著對lnc RNAs功能認識的逐漸深入,越來越多研究表明,lnc RNAs的表達異常與疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關。但目前,關于lnc RNAs與COPD發(fā)病的關系尚不清楚�！狙芯磕康摹勘菊撐闹荚谘芯縧nc RNAs在慢性煙草煙霧誘導的COPD模型小鼠肺組織中的表達變化及生物學功能,為進一步揭示慢性煙草煙霧誘導COPD的病理生理機制提供線索�！狙芯糠椒ā�(1)以LPS聯(lián)合全身煙霧暴露的方式構建COPD小鼠模型,正常對照組小鼠則飼養(yǎng)于清潔干凈環(huán)境中。造模結束后,測定兩組小鼠肺功能、肺泡灌洗液炎性細胞分類計數(shù)、Muc5AC含量、肺組織病理等。并對兩組小鼠提取肺組織中的RNA,進行RNA測序及生物信息學分析,并從中選擇部分顯著差異表達的lnc RNAs及蛋白編碼基因進行q RT-PCR驗證。通過檢索NCBI數(shù)據庫,獲取小鼠lnc RNAs和蛋白編碼基因的人類同源分子的堿基序列后,分別在CSE刺激16HBE和A549細胞中,以及COPD患者和健康對照組PBMCs中,進行上述lnc RNAs和蛋白編碼基因的q RT-PCR驗證。(2)擴大COPD患者的樣本量,分別在COPD患者和健康對照者的PBMCs中、煙草煙霧暴露7天和3個月的小鼠肺組織中、CSE刺激mle12細胞中,進行Fantom3_F830212L20和Nqo1的檢測�！狙芯拷Y果】1.lnc RNAs以及其相關的蛋白編碼基因在COPD模型小鼠肺組織中的表達變化以及生物信息學分析結果綜合COPD模型小鼠和對照組小鼠的肺功能、BALF炎性細胞分類計數(shù)、Muc5AC含量以及肺組織病理等結果,評估慢性煙草煙霧誘導COPD模型小鼠構建成功。兩組小鼠肺組織RNA測序結果顯示,COPD模型小鼠肺組織中l(wèi)nc RNAs及m RNAs的表達水平,明顯不同于對照組小鼠。以fold change2及padj0.05作為判斷標準,共有109個lnc RNAs和260個m RNAs在COPD模型小鼠及對照組小鼠肺組織中顯著差異表達。將顯著表達差異的lnc RNAs可能靶向的蛋白編碼基因,與260個顯著表達差異的m RNAs進行交集后,共獲得44個與lnc RNA相關的,可能受lnc RNAs調控的,且本身也在COPD模型小鼠肺組織中顯著差異表達的蛋白編碼基因。對這些蛋白編碼基因進行GO分析,結果顯示這些蛋白編碼基因主要富集在細胞對干擾素β反應方面(基因生物學過程)、與GTP結合方面(分子功能)以及細胞漿方面(細胞組分)。KEGG分析結果顯示,這些蛋白編碼基因主要與內質網的蛋白加工處理以及�；撬岷蛠喤；撬嵬�路的信號通路有關。化學物富集分析結果顯示,這些蛋白編碼基因主要富集在煙草煙霧暴露的通路方面。從上述顯著表達差異的lnc RNAs和蛋白編碼基因中選擇相關系數(shù)0.95的lnc RNAs和蛋白編碼基因對,構建了lnc RNAs-蛋白編碼基因的共表達網絡圖。其次,將本論文研究中顯著表達差異的44個蛋白編碼基因,與GEO數(shù)據庫中COPD患者的高通量數(shù)據進行交集后發(fā)現(xiàn),IL1R1、UCHL1、GGT5等3個蛋白編碼基因同時在COPD模型小鼠肺組織以及COPD患者肺組織和/或PBMCs中顯著表達差異。從顯著表達差異的lnc RNAs和蛋白編碼基因中,共挑選了14個lnc RNAs及14個蛋白編碼基因,在另外選取的COPD模型小鼠和對照組小鼠肺組織中進行了q RT-PCR驗證分析,結果顯示這些lnc RNAs及蛋白編碼基因在COPD模型小鼠肺組織中的表達趨勢,與RNA測序結果顯示的表達趨勢一致。2.lnc RNAs人類同源分子以及其相關的蛋白編碼基因,在CSE刺激的16HBE細胞、A549細胞以及COPD患者PBMCs中的表達變化通過序列比對分析發(fā)現(xiàn),上述進行了q RT-PCR驗證的14個lnc RNAs中,共有11個lnc RNAs能找到人類同源分子。q RT-PCR結果顯示,共有8個lnc RNAs人類同源分子(Fantom3_F830212L20、Fantom3_7420409G12、NR_028593、NR_033450、Fantom3_C130011B08、Fantom3_2810049O06、NR_102714、Fantom3_D330021G15)和7個蛋白編碼基因(UCHL1、NR1D2、PER3、HLF、AHRR、NQO1、SERPINA3)在CSE刺激的16HBE細胞中的表達趨勢,與它們在COPD模型小鼠肺組織中的表達趨勢相同;共有7個lnc RNAs的人類同源分子(Fantom3_C130011B08、Fantom3_7420409G12、Fantom3_D830009E10、NR_033450、NR_033355、NR_102714和Fantom3_F830212L20)和7個蛋白編碼基因(NR1D2、NQO1、AHRR、GGT5、HSPA5、FKBP4、UCHL1)在CSE刺激的A549細胞中的表達趨勢,與它們在COPD模型小鼠肺組織的表達趨勢相同;共有2個lnc RNAs人類同源分子(NR_102714和NR_028593)和7個蛋白編碼基因(UCHL1、DNAJA1、GGT5、FKBP4、IL1R1、HSPA1A和HSPA5)在COPD患者PBMCs中的表達趨勢與它們在COPD模型小鼠肺組織中的表達趨勢相同。3.COPD患者、煙草煙霧暴露7天及3個月小鼠的氧化應激指標,以及Fantom3_F830212L20(或其人類同源分子)和Nqo1表達水平的檢測COPD患者血漿以及煙草煙霧暴露7天及3個月小鼠肺組織中GSSG等氧化應激指標,較之對照組均有升高趨勢。其次,COPD患者PBMCs中Fantom3_F830212L20人類同源分子和NQO1表達量較之健康對照組均有升高趨勢,且COPD患者吸煙量與其血漿GSSG水平以及PBMCs中Fantom3_F830212L20人類同源分子和NQO1的相對表達量均呈正相關。此外,煙草煙霧暴露7天及3個月小鼠肺組織中Fantom3_F830212L20、Nqo1 m RNA及蛋白表達水平均高于正常對照組小鼠。4.CSE刺激mle12細胞中Fantom3_F830212L20、Nqo1 m RNA和蛋白表達水平的變化CSE刺激的mle12細胞中Fantom3_F830212L20及Nqo1 m RNA表達水平均隨CSE刺激濃度升高而升高,且Fantom3_F830212L20和Nqo1 m RNA相對表達量均隨CSE刺激時間延長而呈遞減趨勢。Nqo1蛋白表達水平則隨CSE刺激濃度升高而升高,并隨CSE刺激時間延長而升高。以si RNA沉默F(xiàn)antom3_F830212L20后,在0及0.5%CSE刺激下,mle12細胞內Nqo1 m RNA及蛋白表達水平,以及細胞內GSH水平,均低于對照組�！窘Y論】1.在煙草煙霧誘導的COPD模型小鼠肺組織中,共發(fā)現(xiàn)109個lnc RNAs及260個m RNAs顯著差異表達。這些差異表達的lnc RNAs相關的蛋白編碼基因的生物學功能主要富集在內質網蛋白加工處理以及�；撬岷蛠喤；撬嵝盘柾�路。2.Lnc RNA NR_102714(或NR_102714人類同源分子)及其相應的蛋白編碼基因UCHL1在煙草煙霧誘導的COPD小鼠肺組織、CSE刺激的氣道上皮細胞以及COPD患者外周血PBMCs中均有相同的表達趨勢,提示它們可能共同調控COPD的發(fā)生發(fā)展。3.Lnc RNA Fantom3_F830212L20在煙草煙霧誘導的小鼠肺組織和肺泡上皮細胞中高表達,可能正向調控Nqo1表達,降低煙草煙霧誘導的氧化應激反應。4.在COPD患者PBMCs中,Fantom3_F830212L20人類同源分子和NQO1表達量均高于正常健康者;COPD患者吸煙量與PBMCs中Fantom3_F830212L20人類同源分子和NQO1的表達量均呈正相關。Fantom3_F830212L20人類同源分子和NQO1的調控關系有待進一步研究。
【學位單位】：廣州醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R563.9
【部分圖文】：

圖 2 COPD 模型小鼠肺中，BALF 的炎性細胞分類計數(shù)、Muc5AC 含量以及肺泡平均截距Control 表示正常對照組小鼠，CS 表示 COPD 模型小鼠。(a) BALF 的炎性細胞分類計數(shù)；(b) BALF 的 Muc5AC 含量；(c) 肺泡平均截距。統(tǒng)計方法為 one-way ANOVA，**P＜0.01N=6。2122232425200.10.20.30.40.50.60.70.80.91Total Neutrophils Macrophages LymphocytesEosinophil******CelnumberinBALfluid(104/ml00.51Muc(foldof0102030405060Averagealveolarintercept(μm)**c Control CSControl CS

44圖 4 各個測序標本 RNA 測序數(shù)據的質量評估（a）表示測序數(shù)據(Raw Data)中帶接頭的 reads、低質量 reads、包含 N（N 表示無法確定堿基信息）的 reads、包含核糖體 RNA 的 reads、其他不合格的不能用于數(shù)據分析的 reads，以及能用于數(shù)據分析的有效 reads 的百分比。（b）將有效的 reads 與小鼠參考基因組進行序列比對后統(tǒng)計得到的 reads 在外顯子區(qū)、剪切區(qū)、內含子區(qū)、基因間隔區(qū)的分布百分比。（c）有效的 reads 在染色體上的分布情況。Sample 1～Sample 3為正常對照組小鼠的肺組織，Sample 4～Sample 6 為 COPD 小鼠模型的肺組織。

46 5 lncRNAs 和 mRNAs 在 COPD 模型小鼠和正常對照小鼠肺組織表達情況的聚類分ncRNAs；(b)mRNAs。熱圖中，每個小方格表示每個 lncRNAs 或 mRNAs。不同的顏色ncRNAs 或 mRNA 的表達量大小，表達量越大，顏色越深（紅色表示表達上調，綠色下調）。每行表示每個 lncRNAs 或 mRNAs 在不同樣本中的表達量情況，每列表示每
【參考文獻】

相關博士學位論文 前1條

1 王品;非編碼RNA對人NK細胞與樹突狀細胞免疫功能的調控作用及相關機制研究[D];第二軍醫(yī)大學;2013年

本文編號：2892909