核因子κB活化與成纖維細胞表型轉化在肺間質纖維化中的作用

發(fā)布時間：2020-11-22 03:54

　　實驗目的間質性肺疾病(ILD)是由200余種疾病組成的一類疾病,他們在臨床表現(xiàn)、實驗室和病理學改變上具有一定共同特點,但又有各自不同的特征。成纖維細胞活化、增殖及大量細胞外基質聚集是肺纖維化的主要病變特征,多種因素均可引起肺纖維化,如職業(yè)性粉塵(SiO_2等)、病毒(冠狀病毒等)、放射性損傷及某些藥物(博萊霉素等),此外還有一類不明病因的肺纖維化—特發(fā)性肺纖維化。雖然起因不同但纖維化的發(fā)展與結局基本相似,目前肺纖維化發(fā)生的確切機制尚不清楚,早期有效防治亦未獲得突破性進展。核因子-κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)是大多數細胞因子表達的一個關鍵性轉錄調控因子,NF-κB的活化與肺間質纖維化發(fā)病關系密切,阻斷NF-κB活化有可能是治療肺間質纖維化的重要手段。NF-κB抑制蛋白(inhibitory NF-κB,IκB)是胞漿內NF-κB的抑制物,對NF-κB的功能具有重要的調節(jié)作用。成纖維細胞轉化為表達α-平滑肌動蛋白的肌成纖維細胞在肺間質纖維化病理過程中具有重要作用。本文旨在研究NF-κB的活化對肺成纖維細胞向肌成纖維細胞轉化的影響,以及在這一過程中,IκB對NF-κB的調節(jié)作用,從而為肺間質纖維化的防治提供理論依據。實驗方法 1、動物模型的建立、分組將12只C57BL/6雌性小鼠(8周齡、體重18-20克、無特殊病原體SPF級、北京維通利華實驗動物技術公司)隨機分成兩組,每組6只。小鼠10%水合氯醛(3ml/kg)腹腔注射麻醉后,無菌手術暴露氣管,模型組氣管內注入博萊霉素A5(5mg/kg、日本化藥株式會社、批號:Y60520、溶于20μl的無菌生理鹽水)。對照組氣管內注入生理鹽水20μl。 2、細胞培養(yǎng) 兩組小鼠分別于氣管內注射處置后第1及第3天隨機取3只。用組織塊貼壁法原代培養(yǎng)肺組織成纖維細胞,并傳4代。 3、成纖維細胞的鑒定倒置顯微鏡下觀察培養(yǎng)過程中細胞的形態(tài)變化;免疫細胞化學方法鑒定波形蛋白和角蛋白的表達。 4、檢測指標及方法對原代培養(yǎng)并傳4代的細胞爬片進行p65、IκB-α及α-SMA免疫細胞化學染色以檢測各指標蛋白的表達,用原位雜交檢測p65及IκB-αmRNA的表達。并用MetaMorph圖像分析系統(tǒng)對免疫細胞化學及原位雜交結果進行定量分析。分析各指標間相關性,研究成纖維細胞α-SMA的表達與NF-κB的關系。實驗結果 1、原代培養(yǎng)的成纖維細胞特征典型,并通過傳代培養(yǎng)得到了純化的成纖維細胞。培養(yǎng)細胞形態(tài)學變化:第3～4代細胞形態(tài)較為均一,呈長梭形,顯微鏡下可見1～2個核仁;細胞之間界限清晰,呈魚群狀或柵欄狀排列。 2、免疫細胞化學鑒定結果:免疫細胞化學檢測原代細胞表達波形蛋白強陽性,角蛋白散在灶性個別細胞弱陽性;第4代細胞均表達波形蛋白強陽性,角蛋白呈陰性表達。 3、在博萊霉素誘導的肺間質纖維化的病理過程中,p65、IκB-α和α-SMA的蛋白及p65、IκB-α的mRNA表達均較對照組的表達明顯增強(P＜0.01)。 4、p65與IκB-α的蛋白表達呈正相關(r=0.801,P＜0.05),與α-SMA蛋白表達呈正相關(r=0.764,P＜0.05);p65與IκB-α的mRNA表達呈正相關(r=0.731,P＜0.05)。結論 1、采用組織塊帖壁培養(yǎng)法成功地培養(yǎng)了肺成纖維細胞。 2、肺纖維化模型動物存在成纖維細胞向肌成纖維細胞的表型轉化,肌成纖維細胞的持續(xù)存在是肺纖維化發(fā)生的關鍵因素之一。 3、核因子κB活化可能在成纖維細胞向肌成纖維細胞表型轉化中起關鍵性作用,并因此在肺間質纖維化中發(fā)揮重要的作用。 4、IκB-α通過抑制NF-κB的活化發(fā)揮抗纖維化的作用。
【學位單位】：中國醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2008
【中圖分類】：R563.9
【部分圖文】：

肺成纖維細胞,小鼠,角蛋白,陰性