發(fā)布時間：2020-11-16 18:42

　　 研究背景:隨著我國經(jīng)濟建設(shè)的快速發(fā)展,健康問題也受到越來越多的關(guān)注,而慢性腎臟疾病(Chronic kidney disease,CKD)就是其中一個深受關(guān)注的焦點。研究顯示慢性腎臟疾病的發(fā)病率逐年升高,而有效的治療手段卻相當(dāng)匱乏。這一現(xiàn)狀不僅極大的加重了社會及家庭的經(jīng)濟負擔(dān),同時也嚴重的影響了患者的生活品質(zhì)。研究并解決這一現(xiàn)狀已然成為一個極其迫切的現(xiàn)實問題。研究證實Wnt/β-catenin信號通路和腎素-血管緊張素系統(tǒng)(Renin-angiotensin system,RAS)均在腎臟纖維化疾病中起著至關(guān)重要的作用。同時有研究表明RAS組份中的各種信號分子均受到了 Wnt/β-catenin信號通路的直接調(diào)控,如血管緊張素原(Angiotensinogen,AGT),血管緊張素轉(zhuǎn)化酶1(Angiotensin converting enzyme,ACE-1),血管緊張素 Ⅱ(AngⅡ),血管緊張素Ⅱ的1型受體(AngiotensinⅡ AT1-receptor,AT1R)。在早期的研究中證實,不僅是腎臟局部及循環(huán)中的RAS成分對腎臟纖維化的發(fā)生和發(fā)展起著重要的作用,中樞神經(jīng)系統(tǒng)(如下丘腦室旁核,PVN)的RAS也參與了這一過程,并且腎臟局部和中樞神經(jīng)系統(tǒng)之間信號調(diào)節(jié)和反饋機制的研究也取得了積極的進展。但是PVN的wnt/β-catenin信號通路在腎臟纖維化疾病中可能起到的作用、PVN的wnt/β-catenin信號通路和PVN的RAS是否存在某種關(guān)聯(lián)、PVN的wnt/β-catenin信號通路對腎臟局部的wnt/β-catenin信號通路和RAS是否存在關(guān)聯(lián)等問題都尚未被闡明。目的:通過阻斷PVN的Wnt/β-catenin信號通路來探究PVN的wnt/β-catenin信號通路在腎臟纖維化疾病中可能起到的作用、PVN的wnt/β-catenin信號通路和PVN的RAS之間可能存在的關(guān)聯(lián)、PVN的WNT-RAS信號通路和腎臟局部的WNT-RAS可能存在關(guān)聯(lián)等。方法:1、選擇雄性Sprague Dawley(SD)大鼠進行5/6腎切除術(shù)(5/6NX),建立腎臟纖維化疾病模型。于造模后第6周稱量大鼠體重,用尾套法測量大鼠血壓,通過剪尾法采集血液并測量血肌酐、尿素氮,使用代謝籠收集24h尿液并檢測24h蛋白尿。根據(jù)檢測結(jié)果篩選成模大鼠,進行隨機化分組并通過側(cè)腦室注射AAV過表達載體阻斷PVN的Wnt/β-catenin信號通路。2、干預(yù)持續(xù)6周時間,處死前測量血壓,稱量體重,收集24h尿液,之后犧牲并采集血液、腦組織及腎臟組織樣本待檢。3、通過western blot和免疫組化方法檢測中樞PVN及腎臟的wnt/β-catenin信號通路和RAS的活化程度。通過western blot及HE,PAS染色評估腎臟纖維化及腎小球硬化損傷程度。結(jié)果:1、天狼猩紅和PAS染色結(jié)果顯示,5/6NX大鼠和對照組相比出現(xiàn)了明顯的腎臟纖維化及腎小球硬化等病變。2、免疫組化及 western blot 結(jié)果顯示,腎臟及 PVN 的 wnt3a、active-β-catenin、AGT、ACE-1、AT1表達水平均顯著上調(diào),提示腎臟和腦內(nèi)的wnt/β-catenin信號通路及RAS均顯著活化。3、免疫組化及western blot結(jié)果顯示,經(jīng)側(cè)腦室注射含有目的基因DKK1的AAV過表達載體后腎臟及PVN的wnt/β-catenin信號通路及RAS組分包括wnt3a、active-β-catenin、AGT、ACE-1、AT1表達水平均被顯著抑制,且腎臟纖維化等病理改變顯著改善。結(jié)論:1.腎臟纖維化改變不僅和腎內(nèi)WNT-RAS的異�；罨�相關(guān),同時還受中樞WNT-RAS的調(diào)控。2.在腎臟纖維疾病中腦內(nèi)wnt/β-catenin信號通路調(diào)控了 RAS的表達,同時腎臟局部的WNT-RAS信號通路受到腦內(nèi)WNT-RAS信號通路的密切調(diào)控。
【學(xué)位單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R692
【部分圖文】：

同時免疫熒光共定位結(jié)果顯示ＤＫＫ１陽性細胞和ＧＦＰ陽性細胞之間有??良好的相關(guān)性，這些結(jié)果都證實了?ＡＡＶ－ＤＫＫ１過表達載體在大鼠ＰＶＮ中成功過表??達（如圖１－１所示）。??ＧＦＰ?ＤＫＫ１?Ｍｅｒｇｅ?Ｍａｇｎｉｆｙ??ｉｃｖａｃｓＦ??圖１－１．?ＡＡＶ－ＤＫＫｌ過表達載體在ＰＶＮ中成功過表達。實驗中使用了特異性抗體ＧＦＰ?（綠??色）和ＤＫＫ１?（紅色）對ＰＶＮ組織進行免疫熒光共染，白色箭頭指示的是ＧＦＰ和ＤＫＫ１共染呈??陽性的細胞（黃色）。放大倍數(shù)Ｘ?１００；比例尺＝２００?ｕｎｉ。??Ｆｉｇｕｒｅ?１－］：?Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ?ｖｉｒｕｓ?ｖｅｃｔｏｒ?ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ?ｏｖｅｒ－ｅｘｐｒｅｓｓｅｓ?ｔａｒｇｅｔ?ｇｅｎｅ?ＤＫＫ１?ｉｎ?ＰＶＮ．??Ｃｏ－ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ?ｏｆ?ＧＦＰ?ａｎｄ?ＤＫＫ１?ｉｎ?ＰＶＮ?ｗａｓ?ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ?ｂｙ?ｄｏｕｂｌｅ?ｓｔａｉｎｉｎｇ?ｗｉｔｈ?ｔｈｅ?ａｎｔｉｂｏｄｙ?ｏｆ??ａｇａｉｎｓｔ?ＧＦＰ?（ｇｒｅｅｎ）?ａｎｄ?ＤＫＫ１?（ｒｅｄ）．?Ｔｈｅ?ｗｈｉｔｅ?ａｒｒｏｗ?ｉｎｄｉｃａｔｅｓ?ｐｏｓｉｔｉｖｅ?ｃｅｌｌｓ?ｗｉｔｈ?ｃｏ－ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ??ｏｆ?ＧＦＰ?ａｎｄ?ＤＫＫ１?（ｙｅｌｌｏｗ）．?Ｍａｇｎｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｘ?１００；?ｓｃａｌｅ?ｂａｒ?＝２００｜．ｉｍ．??２．２?ＰＶＮ的ｆｆｎｔ／Ｐ－ｃａｔｅｎｉｎ信號通路在５／６ＮＸ大鼠中顯著活化

ｃａｔｅｎｉｎ的表達水平顯著升高，這也預(yù)示著ＰＶＮ的Ｗｎｔ／?０?－ｃａｔｅｎｉｎ信號通路與??腎臟纖維化病變密切相關(guān)。同時，側(cè)腦室注射ＡＡＶ－ＤＫＫ１可以顯著的抑制Ｗｎｔ／Ｐ－??ｃａｔｅｎｉｎ信號通路的異常活化（如圖１－２所示）。??Ａ?ＩＣＶａＣＳＦ?ＩＣＶ?０ＫＫ１?ｎ??Ｍ?Ｓｈａｍ?＋５／６ＮＸ?＋５／６ＮＸ?°?°?ｗ１ｆ３ａ??ｔａｏ－ｉ?Ｅ３３?ａｏｌｒｖ＾?－ｃｓ＾ｒａｎ??！?＊??ｗｎｔ３ａ?．?｜?１００－?＊?參??ｒ??ａｃｔｉｖｅ－３?＊?．?廣?＋?＋??？ｃａｔｅｎｍ?＂?＾?＾??ｒ?ｎ?＾??ＩＣＶａＣＳＦ?ＩＣＶ０ＫＫ１?ｆ?ｐ＾７３??Ｓｈａｍ?４－５／６ＮＸ?＾／６ＮＸ?？０Ｊ＇????＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿?＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿?＊〇?Ｑ?ｗＸｗ－；??ｗｗ?＾?�。�?ｏｅ－?ｍ?？??ａｃ，，ｖｅ＾??－ｍ?－?ｆ?０４＇?丁??—?ｊｉ?〇，＾?ｍ??ｅ．ａｔｔｉｎ?ｆ?〇Ｊｋｍｄ?？?＾??Ｅ．二．一一一＃ａ?ｙ?ｙ??圖１－２．?ＰＶＮ的Ｗｎｔ／?Ｐ?－ｃａｔｅｎｉｎ信號通路在５／６ＮＸ大鼠中顯著活化

ＡＣＥ－１、ＡＴＩ表達水平顯著升高。同時，通過側(cè)腦室注射ＡＡＶ－ＤＤＫ１阻斷ＰＶＮ的??ｗｎｔ／Ｐ－ｃａｔｅｎｉｎ信號通路可以顯著的抑制ＰＶＮ的ＲＡＳ活性，這一結(jié)果提示ＰＶＮ??的ｗｎｔ／?Ｐ?－ｃａｔｅｎｉｎ信號通路對ＰＶＮ的ＲＳＡ存在緊密的調(diào)控作用（如圖１－３所。??ＩＣＶ?ａＣＳＦ?ＩＣＶ?ＤＫＫ１??Ｓｈａｍ?＋５／６ＮＸ?＋５／６ＮＸ??Ａ?Ｂ??ＡＧＴ?ｍ?ＡＧＴ??１５０－?￡２３?ＡＣ￡??｜?〇?ＡＴＩ??．？？？￣?ｕ??－?Ｉ?１００－?＾?＊??ｌ１?ｉｉ??ＡＴＩ?＞？?＃??ＩＣＶ?ａＣＳＦ?ＩＣＶ?ＤＫＫ１??Ｓｈａｍ?＋５／６ＮＸ?＋５／６ＮＸ??Ｃ?Ｄ?１?ａ?ａｇｔ??勺？?￡２３?ＡＴＩ??ｉｓ?．?ｉ?ｉ??．．．?ｉｔ?－而?６義?ｉｌ??—＿＿丨＿丨丨丨丨酬釀＞?｜＜?ｍｉ?Ｈｉ?ｍ??Ｐ－ｄｃｔｉｎ?１?＿Ｎ＿ＭＭＭＭＲＭＭＨＭＨＭＭＲＭＮｉＨＲＲＭＲＨＨＨｌＮＮＨＨＭＨＲＰ；?＾?＾??圖１－３．?ＰＶＮ的ＲＡＳ表達水平在５／６ＮＸ大鼠中顯著上調(diào)，側(cè)腦室注射ＡＡＶ－ＤＫＫｌ可以顯著地??抑制這一改變。（Ａ）免疫組化檢測ＡＧＴ，?ＡＣＥ－１和ＡＴＩ在ＰＶＮ的表達水平。放大倍數(shù)Ｘ?１００；??比例尺＝２００?ｕｍ。（Ｂ）免疫組化的統(tǒng)計結(jié)果的柱狀圖。（Ｃ）?Ｗｅｓｔｅｒｎ?ｂｌｏｔ檢測ＡＧＴ和ＡＴ１在??ＰＶＮ的表達水平。（Ｄ）?Ｗｅｓｔｅｒｎ?ｂｌｏｔ統(tǒng)計結(jié)果的柱狀圖。每組中ｎ＝４／５，?＊Ｐ＜０．?０５?ｉ，ｓ?ｓｈａｍ??組
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