塵肺病(pneumoconiosis)是由于長期吸入生產(chǎn)性粉塵并在肺內潴留而導致的以肺組織不可逆性纖維化為主的全身性疾病,是我國危害最嚴重、涉及人數(shù)最多的職業(yè)病,其中最常見的兩種類型是矽肺(silicosis)和煤工塵肺(coal workers’pneumoconiosis,CWP)。井下煤礦作業(yè)人群的煤工塵肺以混合性塵肺-煤矽肺為多見,占87.6%,單純的矽肺病和煤肺病很少,分別為11.4%和1.0%。2013年我國共報告了新增塵肺病例23152例,占全年新發(fā)職業(yè)病的87.72%,其中95.2%是矽肺病和煤工塵肺。塵肺病發(fā)生發(fā)展的病因、機制復雜,難以完全闡明,塵肺病一個重要的病理特征是,細胞外基質大量沉積。其中層粘連蛋白是一類具有多功能域的基底膜非膠原糖蛋白,由α、β、γ鏈構成的異三聚體,參與基底膜骨架的組裝,影響和調節(jié)細胞的粘附、遷移、分化、增殖等生物學行為,也參與細胞信號的傳導。層粘連蛋白β1鏈(LamB1)由LAMB1基因編碼,在體內分布廣泛,參與組裝至少7種層粘連蛋白亞型。LamB1是肺發(fā)育和維持正常功能所必需的,也被報道參與腎、肝纖維化過程。然而,關于LamB1與塵肺的研究報道較少。雖然長期粉塵暴露是塵肺病的主要病因,但相同暴露條件下,發(fā)病率、病變進展快慢及纖維化嚴重程度的差異提示遺傳因素在塵肺的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。單核苷酸多態(tài)性是研究疾病遺傳易感性的重要工具,可反應個體表型、疾病易感性及對藥物、環(huán)境等影響因素反應的差異。前期對塵肺病進行的全基因組關聯(lián)研究(GWAS),發(fā)現(xiàn)在LAMB1基因上一個多態(tài)性位點rs4320486與塵肺病的發(fā)生危險性存在著相關性。鑒于塵肺病發(fā)病機制復雜,目前尚無有效治療,且缺乏人群特異的血清學指標,深入研究基因多態(tài)性與塵肺病間遺傳易感性的關系,對建立有效的易感性篩查,提高粉塵接觸人群的健康監(jiān)護水平都具有實際意義。目的在前期對塵肺病進行的全基因組關聯(lián)研究(gwas)的基礎上,通過大樣本的病例-對照研究驗證lamb1rs4320486與塵肺病發(fā)生危險性間的關聯(lián);通過人群血清樣本、細胞模型研究rs4320486位點突變對lamb1基因轉錄表達的影響;通過動物模型和體外細胞模型觀察lamb1在纖維化過程中的動態(tài)變化及可能的調控機制,為揭示塵肺病發(fā)病機制、個性化預防及治療提供線索。方法(1)對1091例cwp患者和1042例無塵肺接塵對照進行問卷調查,包括一般人口學資料、接塵史、家族史等,并采集空腹外周靜脈血,采用taqman基因分型法對受試者基因進行分型;(2)構建包含rs4320486(ct)不同等位基因的載體,建立細胞模型,采用雙熒光素酶報告基因發(fā)檢測不同等位基因對lamb1基因轉錄的影響;(3)采用酶聯(lián)免疫吸附法(elisa)檢測不同基因間、病例和對照間血清lamb1濃度;(4)收集正常人肺組織和纖維化人肺組織,qrt-pcr法檢測組織中l(wèi)amb1mrna表達水平的差異;(5)分別建立sio2和blm誘導的小鼠肺纖維化模型,對處理后不同時間截點的小鼠肺組織病理切片進行he染色,觀察不同時間點肺纖維化發(fā)生發(fā)展情況,以確認模型成功建立;(6)分別提取各期小鼠肺組織蛋白和rna,檢測lamb1、上皮標志物e-cadherin、及間質標志物α-sma蛋白及mrna水平的動態(tài)變化;(7)建立sio2處理hbe細胞模型和tgf-β1誘導nih-3t3細胞模型,誘導纖維化病變,通過westernblot和qrt-pcr法確認lamb1與上皮間質標志物的表達情況,細胞免疫熒光直觀展示hbe、nih-3t3細胞中纖維化表達的變化;(8)通過抑制劑特異性阻斷活化的信號通路,研究纖維化中調控lamb1表達的機制。(9)應用epidata對人群調查建立數(shù)據(jù)庫,spss16.0、stata12.0、plink1.07用于數(shù)據(jù)的整理和統(tǒng)計分析。使用imagej進行westernblot條帶灰度值掃描,圖形由graphpad5.0軟件完成。結果1.采用logistic回歸分析,以cc基因型為參照,lamb1rs4320486ct/tt基因型可以顯著降低cwp的發(fā)生危險性(p=0.001),調整年齡、累積粉塵暴露量(cde)、吸煙后or值為0.74,95%ci為0.62~0.88。攜帶t等位基因的個體發(fā)生cwp的危險性是攜帶c等位基因個體的0.76倍(p0.001)。分層分析顯示,ct/tt基因型降低cwp發(fā)生危險性的保護性效應,在年齡68歲組、低cde組及吸煙組人群中更加明顯。此外,采用cox回歸分析不同基因型與cwp病例從接塵到發(fā)病間期的關聯(lián)性,發(fā)現(xiàn)ct/tt基因型可以延緩cwp的發(fā)生(p0.001)。2.從細胞和人群兩個方面觀察分析不同等位基因對lamb1表達的影響。轉染rs4320486pgl3-c等位基因質粒的細胞熒光素酶相對活性顯著高于轉染pgl3-t組細胞(p0.05),在hbe細胞中約為3.6倍,在mrc-5細胞中約1.2倍。此外,elisa檢測48例接塵人員血清lamb1濃度顯示,相同基因型下,病例組的血清濃度高于對照組;在同為病例或同為對照組中,cc基因型個體血清lamb1濃度均略高于ct/tt基因型個體。這些結果提示不同基因型會影響lamb1表達水平的。3.用qrt-pcr檢測肺組織中l(wèi)amb1的表達水平,發(fā)現(xiàn)cwp患者和特發(fā)性肺纖維化(ipf)患者肺組織中l(wèi)amb1的表達水平顯著高于正常人肺組織(p0.05),分別是對照的2.7倍和2.3倍。4.在建立的blm和sio2誘導的c57bl/6小鼠兩種肺纖維化模型中,小鼠肺組織lamb1與間質標志物-α-sma的蛋白與mrna水平均隨著纖維化的發(fā)生發(fā)展呈進行性增高,而上皮細胞標志物-e-cadherin則呈下降趨勢。5.在sio2處理hbe和tgf-β1處理nih-3t3的細胞實驗中,進一步驗證了在肺組織中發(fā)現(xiàn)的結果,處理后可觀察到lamb1的蛋白水平和mrna水平均顯著增加,且隨著處理時間的延長,一直保持高水平。細胞免疫熒光更直觀的展示,與對照組相比,兩個處理組lamb1的表達強度和范圍均增加。6.sio2處理hbe后pi3k-akt信號通路和tgf-β/smad信號通路中下游分子均有表達上調的趨勢,給予pi3k抑制劑ly294002和tgf-β受體1拮抗劑(tβri)ly2157299后,p-akt、p-smad2和smad2表達下調,lamb1的蛋白水平也相應減少,尤其是在ly2157299抑制劑組。結論本研究發(fā)現(xiàn)lamb1基因啟動子區(qū)多態(tài)性位點rs4320486的突變會降低cwp的發(fā)生危險性,也可延緩cwp發(fā)病進程,這與下調lamb1基因的轉錄水平有關;體內動物實驗和體外細胞實驗顯示,隨著肺纖維化的發(fā)生發(fā)展,lamb1的蛋白和mrna表達水平均呈現(xiàn)逐步增加的趨勢,提示lamb1可能在塵肺病的發(fā)生發(fā)展機制中扮演著重要的角色,可能是一種潛在的診斷治療生物標志物和遺傳易感性標志物。
【學位單位】：南京醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2015
【中圖分類】：R135.2
【文章目錄】：縮略語
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英文摘要
1. 前言
2. 材料與方法
3. 結果
4. 討論
5. 結論
參考文獻
綜述
參考文獻
碩士期間發(fā)表論文
致謝
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2851324
