發(fā)布時間：2020-10-23 08:07

　　 目的:探討NRF2信號通路在錳致小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞(TM3細(xì)胞)損傷中的作用及其可能機(jī)制,為錳的生殖毒性機(jī)制研究和NRF2信號通路在錳致TM3細(xì)胞損傷中的生物學(xué)功能以及該通路在疾病中的作用和作用機(jī)制提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù),為后續(xù)的研究和新藥的開發(fā),以及疾病的治療提供新的思路和途徑。方法:通過細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù),將細(xì)胞分為以下幾組,分別是:1、空白對照組(MnCl_2:0μmol/L,C組),2、低劑量染錳組(MnCl_2:100μmol/L,L組),3、中劑量染錳組(MnCl_2:200μmol/L,M組),4、高劑量染錳組(MnCl_2:300μmol/L,H組),5、激動劑對照組(TBHQ:10μmol/L,TC組),6、激動劑+低劑量組(TBHQ:10μmol/L+MnCl_2:100μmol/L,TL組),7、激動劑+中劑量組(TBHQ:10μmol/L+MnCl_2:200μmol/L,TM組),8、激動劑+高劑量組(TBHQ:10μmol/L+Mncl2:300μmol/L,TH組);9、抑制劑對照組(ATRA:10μmol/L,RC組),10、抑制劑+低劑量組(ATRA:10μmol/L+MnCl_2:100μmol/L,RL組),11、抑制劑+中劑量組(ATRA:10μmol/L+MnCl_2:200umol/L,RM組),12、抑制劑+高劑量組(ATRA:10μmol/L+MnCl_2:300μmol/L,RH組);染錳時間均為24小時。用倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài),MTT法測細(xì)胞活力,AnnnexinV/PI雙染色法測凋亡率,DCFH-DA探針測ROS水平,TBA法測細(xì)胞內(nèi)MDA含量,Western Blot及RT-Qpcr技術(shù)測細(xì)胞內(nèi)NRF2、HO-1、GSTpi、SOD、NQO1等蛋白和基因的表達(dá)。結(jié)果:1、MTT實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在染毒24h、48h和72h三個時間段各劑量組中細(xì)胞存活率差異皆有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),且染錳劑量越高,細(xì)胞存活率越低。其他各組與對照組相比,隨著染錳劑量增加,TM3細(xì)胞存活率逐漸降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),且具有劑量-效應(yīng)關(guān)系;加抑制劑前后各劑量組相比,加抑制劑組細(xì)胞存活率有所降低,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);與中高劑量組相比,加激活劑同一劑量組細(xì)胞存活率有所增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),2、在倒置相差顯微鏡下觀察經(jīng)不同染錳濃度(0μmol/L,100 umol/l,,200μmol/L,300μmol/L)以及經(jīng)抑制劑ATRA(10μmol/L)、激活劑TBHQ(10μmol/L)預(yù)處理TM3細(xì)胞1.5h后再染不同濃度錳后,觀察TM3細(xì)胞形態(tài)變化發(fā)現(xiàn)C組和RC組細(xì)胞貼壁牢固,胞體飽滿,分化良好,增殖的細(xì)胞相互連接成單層網(wǎng)狀,胞質(zhì)鋪展,伸出突起。隨著染錳劑量的增加,細(xì)胞逐漸回縮變圓,細(xì)胞漂浮增多,并逐漸產(chǎn)生細(xì)胞碎片。經(jīng)抑制劑ATRA處理再染毒發(fā)現(xiàn),漂浮細(xì)胞更突出,細(xì)胞回縮變圓且產(chǎn)生的細(xì)胞碎片也增多;C組和激活劑TC組細(xì)胞貼壁牢固,分化良好,胞體飽滿,增殖的細(xì)胞連接成單層網(wǎng)狀,胞質(zhì)鋪展,伸出突起,其中TC組細(xì)胞狀態(tài)更好。隨著染錳濃度的增加,以上變化更明顯,經(jīng)激動劑處理再染錳發(fā)現(xiàn),細(xì)胞濃縮變圓及懸浮細(xì)胞不明顯,且產(chǎn)生的細(xì)胞碎片的量不及未加激動劑組多。3、在雙變量流式散點(diǎn)圖中顯示,與C組相比,其他各組凋亡率升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);與未加抑制劑各組相比,加抑制劑同一劑量組凋亡率均升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),而加激活劑同一劑量組組凋亡率均降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);4、DCFH-DA探針檢測細(xì)胞內(nèi)ROS水平發(fā)現(xiàn)不同濃度錳及預(yù)染激活劑TBHQ、抑制劑ATRA再染錳作用于TM3細(xì)胞后,與C組相比,加激活劑前后各組細(xì)胞中的ROS含量均明顯增高,其中濃度越高,TM3細(xì)胞中ROS含量越高;與未加激活劑各組相比,加激活劑各組ROS含量均明顯降低,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);加抑制劑同一劑量組ROS含量均增高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)5、TBA法檢測細(xì)胞內(nèi)MDA水平發(fā)現(xiàn)不同濃度錳及預(yù)染激活劑TBHQ、抑制劑ATRA再染錳作用于TM3細(xì)胞后,與C組相比,加激活劑前后各組細(xì)胞中的MDA含量均明顯增高,且劑量越大,MDA含量越高;與中高劑量組相比,加激活劑同一劑量組MDA含量均明顯降低,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);與低中劑量組相比,加抑制劑同一劑量組MDA含量均明顯增高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)6、Western Blot技術(shù)檢測各組Nrf2、HO-1、NQO1、SOD、GSTpi蛋白的表達(dá)量,與低中高劑量組相比,加抑制劑同一劑量組Nrf2、HO-1、NQO1、SOD、GSTpi的表達(dá)量都下降,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),與M、H組相比,TM、TH組Nrf2、HO-1、NQO1、SOD、GSTpi的表達(dá)量均有所升高(P0.05),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),與TC組相比,TM、TH組Nrf2、HO-1、NQO1、SOD、GSTpi等表達(dá)量隨染錳濃度增加,其表達(dá)量亦逐漸增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。7、利用RT-Qpcr方法測定錳對TM3細(xì)胞以及抑制劑、激動劑處理后再染錳對TM3細(xì)胞中Nrf2、HO-1、NQO1、SOD、GSTpi等基因mRNA表達(dá)的變化,TM3細(xì)胞經(jīng)錳刺激后各組Nrf2mRNA表達(dá)量之間的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);與對照組相比,加激活劑各劑量組HO-1mRNA的表達(dá)量均增高,加抑制劑各劑量組HO-1mRNA的表達(dá)量有所降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05);與未加激活劑抑制劑各組相比,加激活劑組組HO-1mRNA的表達(dá)量均增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05),加抑制劑各組HO-1mRNA的表達(dá)量均降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05);NQO1mRNA的表達(dá)量只有加抑制劑同一劑量組和低中劑量組相比,加抑制劑各劑量組NQO1mRNA的表達(dá)量低于低中劑量組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05));SODmRNA表達(dá)量在加抑制劑各劑量組前后相比,加抑制劑ATRA各劑量組SODmRNA表達(dá)量低于未加抑制劑ATRA同一劑量組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05);GSTpimRNA表達(dá)量在加激活劑前后相比,加抑制劑后各組GSTpimRNA表達(dá)量低于加抑制劑前同一劑量組。差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)。加激活劑前后中高劑量組相比,加激活劑后中高劑量組GSTpimRNA表達(dá)量高于未加中高劑量組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)。結(jié)論:Nrf2信號通路的激活可能是拮抗錳致TM3細(xì)胞氧化損傷的重要機(jī)制之一。
【學(xué)位單位】：遵義醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R114
【部分圖文】：

遵義醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文 朱3 結(jié)果3.1 加入激動劑及抑制劑前染錳對 TM3 細(xì)胞的影響3.1.1 TM3 細(xì)胞生長曲線 數(shù)據(jù)錄入 graphpad 軟件，繪制細(xì)胞生長曲所示，TM3 細(xì)胞隨培養(yǎng)時間延長其 OD 值亦逐漸升高，培養(yǎng) 24h 以后進(jìn)入到長期，60h 以后進(jìn)入平臺期，所以，本次實(shí)驗(yàn)細(xì)胞均選擇培養(yǎng)周期大于 24h 且的細(xì)胞進(jìn)行研究。

MnCl2concentration(umol/L)圖 2 不同時間和濃度 Mn2+對 TM3 細(xì)胞活力的影響Fig.2 Effect of different time and concentration of Mn2+on the activity of TM3 cells.

MnCl2concentration(umol/L)圖 2 不同時間和濃度 Mn2+對 TM3 細(xì)胞活力的影響Fig.2 Effect of different time and concentration of Mn2+on the activity of TM3 cel
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2852765