發(fā)布時間：2020-10-23 01:30

　　 目的:三丁基錫(tributyltin,TBT)是一種常見的有機(jī)錫類化合物,可作為木材防腐劑、船體防污劑而被廣泛使用。作為常見的環(huán)境內(nèi)分泌干擾物,TBT對海洋生物和哺乳動物造成嚴(yán)重危害,主要涉及生殖、神經(jīng)、免疫、內(nèi)分泌和肝臟等毒性。作為人體主要的代謝解毒器官,肝臟也是TBT的靶器官。本課題組前期選用人正常肝臟來源的細(xì)胞系HL7702細(xì)胞,應(yīng)用基因組學(xué)技術(shù)對TBT的肝毒性機(jī)制進(jìn)行了系統(tǒng)研究,發(fā)現(xiàn)TBT引起的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可能是TBT致肝毒性的重要原因。在此基礎(chǔ)上,本研究將應(yīng)用高通量的蛋白組學(xué)技術(shù)對TBT引起肝細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激進(jìn)行深入探索,以期進(jìn)一步闡明TBT誘導(dǎo)肝細(xì)胞損傷的機(jī)制。方法:1.用MTT法檢測HL7702細(xì)胞暴露于不同濃度的TBT(0、2、4、6、8、10μM)2h后細(xì)胞增殖活力。2.HL7702細(xì)胞暴露于TBT后提取總蛋白,用標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組i TRAQ?檢測所有蛋白的表達(dá)水平。3.用Proteinpilot軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)定性和定量分析,篩選出TBT暴露組相對于對照組的差異表達(dá)蛋白。4.對蛋白組學(xué)中發(fā)現(xiàn)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)的基因進(jìn)行實時熒光定量PCR驗證。5.運用蛋白免疫印跡技術(shù)對蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果中發(fā)現(xiàn)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)差異表達(dá)蛋白進(jìn)行驗證。6.透射電鏡下檢測不同濃度TBT處理HL7702細(xì)胞2h后,細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)形態(tài)的變化。結(jié)果:1.TBT暴露影響HL7702細(xì)胞的存活和增殖,并且表現(xiàn)出低濃度毒物促進(jìn)細(xì)胞增殖,高濃度毒物抑制細(xì)胞增殖的趨勢。2.根據(jù)蛋白質(zhì)組實驗,細(xì)胞暴露于低濃度(2μM)、中濃度(6μM)、高濃度(10μM)的TBT后分別出現(xiàn)349、598、801個差異表達(dá)蛋白。3.蛋白質(zhì)組結(jié)果的KEGG通路分析結(jié)果表明,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是TBT肝毒性的主要原因。4.對蛋白質(zhì)組篩選得到的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因用q RT-PCR進(jìn)行驗證,變化趨勢與蛋白組學(xué)結(jié)果一致。5.對蛋白質(zhì)組篩選得到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白用Western Blot進(jìn)行驗證,變化趨勢與蛋白組學(xué)結(jié)果一致。6.電鏡下可以看到低濃度TBT處理的實驗組細(xì)胞核固縮、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔擴(kuò)張、核糖體脫落,表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生,隨著染毒濃度的進(jìn)一步升高,細(xì)胞死亡解體。結(jié)論:蛋白質(zhì)組分析結(jié)果表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是TBT肝毒性作用的主要原因。ATF6、PERK、IRE1三種感受蛋白介導(dǎo)的未折疊蛋白反應(yīng)通路全部參與了TBT誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。
【學(xué)位單位】：寧波大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R114
【部分圖文】：

iTRAQ操作流程圖

圖 3.1 TBT 對 HL7702 細(xì)胞增殖的影響Fig.3.1 Cell viability after HL7702 cells treated with TBT(*P<0.05，**P<0.01) 蛋白組學(xué)聚類分析對差異表達(dá)的蛋白進(jìn)行聚類分析，得到一張熱圖。圖中綠色表示各基因表降，紅色代表各基因表達(dá)水平上升，黑色代表各基因表達(dá)水平不變。結(jié)果聚類良好，其中中濃度組與高濃度組表達(dá)情況接近。

24圖 3.2 蛋白聚類分析Fig.3.2 Protein cluster analysis3.3 蛋白質(zhì)組結(jié)果3.3.1 蛋白質(zhì)組結(jié)果總體情況根據(jù)可信蛋白篩選標(biāo)準(zhǔn)：Unused > 1.3 且 peptides（肽段數(shù)）大于等于 2 條，去除反庫數(shù)據(jù)以及比值為空白的無效值。根據(jù)差異表達(dá)蛋白篩選標(biāo)準(zhǔn)：Foldchange 為1.5 倍，即倍數(shù)變化大于 1.5 或小于 0.67，直接采用兩比較組樣品幾次重復(fù)的相對定量值的的平均值進(jìn)行計算。并且 Dynamics 中進(jìn)行了動態(tài)分析，對同一蛋白在不同比較組中進(jìn)行了分析，在任意一組中為差異蛋白的蛋白均被列出。最終得到：可信蛋
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本文編號：2852368