發(fā)布時(shí)間：2020-11-04 15:34

　　 目的:流行病學(xué)調(diào)查顯示大氣PM2.5與心臟發(fā)育疾病相關(guān),動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也表明其導(dǎo)致心臟畸形,但目前分子機(jī)制尚不明確。我們以斑馬魚胚胎為研究模型,研究PM2.5有機(jī)提取物(extractable organic matter,EOM)的心臟發(fā)育毒性及葉酸(Follic Acid,FA)的保護(hù)作用,并從Ahr和Wnt/β-catenin信號(hào)通路的相互作用及DNA甲基化調(diào)控角度深入研究其分子機(jī)制。方法:(1)PM2.5收集:收集蘇州市區(qū)PM2.5,分析其成分并用索氏提取法提取有機(jī)組分。(2)整體胚胎實(shí)驗(yàn):取不同濃度的EOM對(duì)斑馬魚胚胎染毒,并給予Ahr抑制劑CH223191(CH)和β-catenin激活劑CHIR99021(CHIR),在體視顯微鏡下觀察72hpf時(shí)斑馬魚胚胎的發(fā)育情況,主要包括胚胎孵化率、心率、心臟畸形率;以qPCR檢測(cè)Ahr和Wnt/β-catenin通路相關(guān)基因mRNA的表達(dá);以Western Blot檢測(cè)β-catenin蛋白的表達(dá);以EROD實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Cyp1a1活性。(3)分離心臟實(shí)驗(yàn):用5mg/L濃度的EOM染毒斑馬魚胚胎,同時(shí)補(bǔ)充0.05μM葉酸,在體視顯微鏡下觀察72hpf時(shí)不同處理組的斑馬魚胚胎發(fā)育情況。分離出胚胎心臟,用qPCR和熒光顯微鏡檢測(cè)分離心臟的純度;以qPCR檢測(cè)不同處理組心臟中Ahr和Wnt/β-catenin通路及DNA甲基化相關(guān)基因mRNA的表達(dá);以Western Blot檢測(cè)心臟中Ahr和β-catenin的蛋白表達(dá)水平;以COBRA檢測(cè)c-fos基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平;以EROD檢測(cè)Cyp1a1活性。結(jié)果:(1)EOM引起斑馬魚胚胎心臟畸形升高和心率下降,Ahr抑制劑CH和Wnt激活劑CHIR能拮抗EOM引起的心臟缺陷;EOM可以導(dǎo)致Ahr靶基因(Cyp1a1、Cyp1b1和Ahrra)表達(dá)的升高,降低β-catenin靶基因(Axin2,Nkx2.5和Sox9b)的表達(dá),同時(shí)能降低Rspo2基因(β-catenin的上游基因)的表達(dá);補(bǔ)充CH/CHIR能減輕EOM導(dǎo)致的大部分基因表達(dá)改變并引起Ahrrb(Ahr抑制基因)的表達(dá)升高。(2)補(bǔ)充葉酸降低EOM導(dǎo)致的斑馬魚心臟畸形,并且Ahr抑制劑CH和Wnt激活劑CHIR都提高了葉酸的保護(hù)效率。對(duì)于Ahr和Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)基因,EOM在分離的心臟中引起類似于全胚胎中的mRNA表達(dá)變化。EOM還引起DNA甲基化修飾相關(guān)基因mRNA表達(dá)異常以及DNA甲基化變化,補(bǔ)充葉酸則有拮抗作用。特別是EOM所致分離心臟中c-fos基因啟動(dòng)子區(qū)DNA高甲基化和mRNA低表達(dá)在補(bǔ)充葉酸后均得到顯著改善。EROD實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了葉酸抑制EOM對(duì)Cyp1a1的激活。此外,葉酸還拮抗EOM所引起的β-catenin和Ahr蛋白表達(dá)改變。結(jié)論:EOM能夠激活斑馬魚胚胎心臟中Ahr活性,并抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路,從而導(dǎo)致心臟發(fā)育畸形;葉酸可能通過穩(wěn)定DNA甲基化拮抗EOM引起的Ahr和Wnt/β-catenin信號(hào)通路變化。我們的研究提示葉酸可用于防治大氣PM2.5引起的先天性心臟疾病。
【學(xué)位單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R114
【部分圖文】：

PM2.5主要成分分布

圖 1.2 CH/CHIR 對(duì) EOM 所致斑馬魚胚胎心臟畸形的影響(n=4)（圖A. 斑馬魚胚胎圖片，箭頭表示心臟畸形。0、0.2、1、5代表EOM的濃度（mg/L）B. 不同藥物處理的斑馬魚胚胎心臟畸形率統(tǒng)計(jì)； CH:CH223191；CHIR:CHIR99021;CCHIR的濃度分別為0. 5和1μM不同字母代表有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。）

補(bǔ)充CH/CHIR前后暴露于EOM中斑馬魚胚胎的心率和孵化率(n=4)
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本文編號(hào)：2870276