發(fā)布時間：2020-03-21 18:38

【摘要】：目的建立D-半乳糖致神經(jīng)干細胞體外老化模型,人參皂苷干預(yù)老化神經(jīng)干細胞以后,量化神經(jīng)干細胞內(nèi)維持生物學(xué)特性的兩個內(nèi)源轉(zhuǎn)錄因子SOX2和BMI-1的表達變化,探討人參皂苷維持和增強老化神經(jīng)干細胞生物學(xué)特性的作用。方法1選取孕15-17天大鼠,采用機械分離胚鼠海馬NSCs的方法獲得原代NSCs,之后傳代培養(yǎng)。對NSCs進行特異性標(biāo)志物Nestin鑒定,使用免疫熒光染色的方法。2CCK-8法篩選D-半乳糖致神經(jīng)干細胞體外老化模型的最佳濃度和最佳時間。設(shè)置6個不同時間點(6h、12h、24h、48h、60h、72h),種6板,在每個板內(nèi)設(shè)Dmem組、對照組以及不同劑量組(5、10、15、20、25、30、35、40mg/ml),之后加CCK-8,1-4h后用酶標(biāo)儀測定在450nm處的吸光度,整理數(shù)據(jù),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。3使用課題組前期用MTS法檢測NSCs細胞增殖能力篩選出的人參皂苷最佳劑量(lug/ml)及最佳作用時間(24h),采用CCk-8法檢測人參皂苷對D-半乳糖致神經(jīng)干細胞體外老化模型中老化神經(jīng)干細胞的影響。4使用Western Blot法檢測人參皂苷作用老化神經(jīng)干細胞后神經(jīng)干細胞內(nèi)SOX2和BMI-1蛋白的表達情況,實驗分為正常組、老化組和老化加人參皂苷組。首先對三組NSCs細胞提取蛋白,按照蛋白提取試劑盒操作指示進行操作,制備蛋白樣品,SDS-PAGE電泳,敷一抗二抗,最后使用凝膠成像儀檢測目標(biāo)蛋白,使用Image Pro Plus7.0軟件對條帶結(jié)果進行分析統(tǒng)計。5免疫熒光及細胞核染色檢測正常神經(jīng)干細胞,老化神經(jīng)干細胞及人參皂苷作用老化神經(jīng)干細胞后神經(jīng)干細胞內(nèi)特異性標(biāo)志物Nestin,以及SOX2和BMI-1的表達情況。實驗分為正常組、老化組、老化加人參皂苷組,在細胞培養(yǎng)、造模、加人參皂苷并進行前期的免疫熒光常規(guī)實驗操作以后,加入相應(yīng)的Nestin、BMI-1、SOX2一抗二抗,加DAPI染色,封片后,在激光共聚焦顯微鏡下觀察熒光標(biāo)記的細胞并拍照并通過Image Pro Plus7.0圖像分析軟件分析其陽性細胞數(shù)、面密度和光密度。結(jié)果1成功分離培養(yǎng)胚鼠海馬NSCs,并經(jīng)免疫熒光證明其表達NSCs特異性標(biāo)記物Nestin,可進行原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng),純度為95%以上NSCs。2 D-半乳糖致神經(jīng)干細胞體外老化模型的最佳濃度劑量是35mg/ml,D-半乳糖致神經(jīng)干細胞體外老化模型的最佳時間是24h。3采用CCk-8法檢測人參皂苷對D-半乳糖致神經(jīng)干細胞體外老化模型中老化神經(jīng)干細胞的影響與正常組相比,老化組吸光值明顯下降,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。同老化組相比,人參皂苷組吸光值明顯上升,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。4Western Blot法檢測人參皂苷作用老化神經(jīng)干細胞后神經(jīng)干細胞內(nèi)SOX2和BMI-1蛋白的表達情況神經(jīng)干細胞正常組、老化組和人參皂苷組內(nèi)的SOX2和BMI-1蛋白均陽性表達。神經(jīng)干細胞老化組與正常組相比,SOX2表達明顯降低,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.01),神經(jīng)干細胞人參皂苷組與老化組相比,SOX2表達升高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)。神經(jīng)干細胞老化組與正常組相比,BMI-1表達明顯降低,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.01),神經(jīng)干細胞老化加人參皂苷組與老化組相比,BMI-1表達明顯升高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.01)。5免疫熒光及細胞核染色檢測正常神經(jīng)干細胞,老化神經(jīng)干細胞及人參皂苷作用老化神經(jīng)干細胞后神經(jīng)干細胞內(nèi)特異性標(biāo)志物Nestin,以及SOX2基因和BMI-1基因的表達情況NSCs正常組、NSCs老化組和NSCs人參皂苷組均有Nestin、SOX2、BMI-1陽性表達。與NSCs正常組相比,NSCs老化組的Nestin、SOX2、BMI-1面密度、光密度和陽性細胞數(shù)均顯著減少,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01);與NSCs老化組相比,NSCs人參皂苷組的Nestin、SOX2、BMI-1面密度、光密度和陽性細胞數(shù)均增加,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05或P0.01)結(jié)論D-半乳糖致神經(jīng)干細胞體外老化模型的最佳濃度劑量是35mg/ml,最佳時間是24h。人參皂苷可以促進老化NSCs中SOX2和BMI-1表達增加,證明人參皂苷能維持和增強衰老神經(jīng)干細胞生物學(xué)特性,與人參延緩腦老化的臨床作用密切相關(guān)。
【圖文】：

圖７：在不同時間點，同一濃度（３５ｍｇ／ｍｌ）邋Ｄ－ｇａｌ對ＮＳＣ＇ｓ吸光值的影響（ｘ土ｓ，邋ｎ二６）逡逑

４．邋２邋Ｗｅｓｔｅｒｎ邋Ｂｌｏｔ法檢測人參皂苷作用老化神經(jīng)干細胞后神經(jīng)干細胞內(nèi)Ｓ０Ｘ２和ＢＭＩ－１逡逑蛋白的表達逡逑見表２，圖２、３，對神經(jīng)干細胞進行老化造模（３５ｍｇ／ｍｌＤ＿ｇａｌ作用２４ｈ）邋，邋ｌｕｇ／ｍｌ逡逑人參皂苷作用２４ｈ以后，Ｗｅｓｔｅｒｎ邋Ｂｌｏｔ法檢測神經(jīng)干細胞內(nèi)Ｓ０Ｘ２和ＢＭＩ－１蛋白的表達逡逑情況，，由結(jié)果可知，神經(jīng)干細胞正常組、老化組和人參皂苷組內(nèi)的Ｓ０Ｘ２和ＢＭＩ－１蛋白逡逑均陽性表達。神經(jīng)千細胞老化組與正常組相比，Ｓ０Ｘ２表達明顯降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意逡逑義（ｐ＜０．邋０１），yL經(jīng)千細胞人參皂苷組與老化組相比，Ｓ０Ｘ２表達升高，差異具有統(tǒng)計逡逑學(xué)意義（Ｐ＜0．邋０５）。神經(jīng)干細胞老化組與正常組相比，ＢＭＩ－１表達明顯降低，差異具有逡逑統(tǒng)計學(xué)意義（Ｐ＜0．邋０１），神經(jīng)干細胞人參皂苷組與老化組相比，ＢＭＩ－１表達明顯升高，逡逑差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（ｐ＜0．邋０１）逡逑表２各組ＳＯＸ２蛋白的表達與內(nèi)參Ｐ－ａｃｔｉｎ的丨ＯＤ比值（Ｓ土ｓ
【學(xué)位授予單位】：北京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R285

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本文編號：2593766