發(fā)布時(shí)間：2020-03-21 19:49

【摘要】：黃芩苷(baicalin,BA)是從唇形科植物黃芩(Scutellaria baicalensis Georgi)的干燥根莖中提取分離出來的一種黃酮類化合物,其生物活性顯著,具有抗菌、抗炎、抗氧化、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)等藥理作用。BA分子結(jié)構(gòu)中黃酮和葡萄苷酸之間可以形成分子內(nèi)氫鍵,導(dǎo)致其水溶性和脂溶性均較差,口服生物利用度僅為2.2%,從而臨床應(yīng)用得到一定限制。固體脂質(zhì)納米粒(solid lipid nanoparticles,SLN)是粒徑在10-1000 nm范圍內(nèi)的微粒給藥體系,其特點(diǎn)包括毒性低、生物相容性好、生物可降解性,同時(shí)具有很好的靶向性,SLN用以包裹難溶性藥物從而提高其體內(nèi)吸收。前期課題組為了提高BA的口服生物利用度,將其載進(jìn)SLN,制備了黃芩苷固體脂質(zhì)納米粒(BA SLN)。SLN可提高BA的生物利用度,改善BA的吸收,然而SLN提高BA吸收的機(jī)制尚不明確,國內(nèi)外關(guān)于BA SLN口服吸收機(jī)制的研究較少。小腸吸收是藥物吸收過程中關(guān)鍵步驟。最常用到的模型是人結(jié)腸腺癌Caco-2細(xì)胞模型。Caco-2細(xì)胞經(jīng)過一段時(shí)間培養(yǎng)后,其形態(tài)學(xué)、標(biāo)志酶表達(dá)、攝取轉(zhuǎn)運(yùn)及滲透特征均與小腸上皮細(xì)胞類似,所以常被用于藥物經(jīng)小腸上皮細(xì)胞吸收機(jī)制的研究。本課題在既往工作基礎(chǔ)上,建立Caco-2細(xì)胞攝取和轉(zhuǎn)運(yùn)模型,考察BA及BA SLN在腸上皮細(xì)胞的攝取轉(zhuǎn)運(yùn)特性,初步闡釋SLN提高BA小腸吸收的機(jī)制,以期為BA SLN的處方設(shè)計(jì)提供理論依據(jù)。目的:探究BA及BA SLN在Caco-2細(xì)胞模型中攝取特性和轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)理,初步闡明BA及BA SLN經(jīng)腸上皮細(xì)胞的吸收機(jī)制。方法:建立體外Caco-2細(xì)胞攝取和轉(zhuǎn)運(yùn)模型,觀察細(xì)胞形態(tài),跨膜電阻值(TEER)和頂端側(cè)(AP)與基底側(cè)(BL)的堿性磷酸酶(ALP)的活性比值檢測細(xì)胞單層的致密性和極化特征;利用CCK-8法和LDH法檢測BA及BA SLN對Caco-2細(xì)胞的毒性,篩選出安全的給藥濃度;建立細(xì)胞中BA的含量測定方法,并進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證;通過研究時(shí)間、濃度、溫度和內(nèi)吞抑制劑對BA和BA SLN的Caco-2細(xì)胞攝取量的影響探究BA和BA SLN入胞方式及攝取特性;轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)檢測出BA及BA SLN在Caco-2細(xì)胞上的表觀滲透系數(shù)(Papp)和外排率(ER);激光共聚焦顯微鏡檢測Zona occluding-1(ZO-1)的分布;采用P-糖蛋白(P-gp)、多藥耐藥相關(guān)蛋白2(MRP2)和乳腺癌耐藥蛋白(BCRP)蛋白抑制劑研究外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對BA和BA SLN的轉(zhuǎn)運(yùn)影響;Western blotting法檢測ZO-1、P-gp、MRP2和BCRP蛋白的表達(dá)。結(jié)果:1.Caco-2細(xì)胞攝取、轉(zhuǎn)運(yùn)模型的建立及毒性檢測Caco-2細(xì)胞培養(yǎng)5-7天左右,在倒置顯微鏡下觀察,基本達(dá)到融合,邊界清楚,呈鋪路石狀;培養(yǎng)至14天,形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果顯示細(xì)胞均勻、致密。Caco-2細(xì)胞單層TEER隨培養(yǎng)時(shí)間的延長而增高,17及21天時(shí),TEER值分別為545.84Ω·cm~2、556.98Ω·cm~2;此細(xì)胞模型AP側(cè)與BL側(cè)的ALP活性比值隨培養(yǎng)時(shí)間的延長而增高,培養(yǎng)14及21天時(shí),其比值分別為5.05±0.09、9.10±0.25,可用于細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)。CCK-8法檢測BA及BA SLN對Caco-2細(xì)胞的毒性,隨著藥物濃度的增加,細(xì)胞存活率有降低趨勢;當(dāng)BA及BA SLN濃度在0-150μg/mL時(shí),孵育24 h后細(xì)胞存活率均與空白組沒有顯著差異;LDH法檢測細(xì)胞膜的完整性,在0-150μg/mL濃度范圍內(nèi),乳酸脫氫酶的釋放率無明顯變化;藥物濃度達(dá)到150μg/mL以上,乳酸脫氫酶釋放率明顯增加。2.黃芩苷固體脂質(zhì)納米粒在Caco-2細(xì)胞模型中的攝取特性藥物濃度為150μg/mL時(shí),0-1 h內(nèi)BA及BA SLN在Caco-2細(xì)胞攝取量隨時(shí)間延長而增加。0-150μg/mL系列濃度的BA及BA SLN在Caco-2細(xì)胞中攝取1 h,攝取量隨濃度的增加而增大,且每個(gè)濃度下,BA SLN溶液的細(xì)胞攝取量均顯著高于BA溶液。藥物濃度為150μg/mL時(shí),分別于4°C和37°C下孵育1 h,BA及BA SLN在Caco-2細(xì)胞中攝取量隨溫度升高而明顯增加。當(dāng)內(nèi)吞抑制劑β-環(huán)糊精和氯丙嗪存在時(shí),BA在Caco-2細(xì)胞上的攝取量沒有明顯的變化,而BA SLN在Caco-2細(xì)胞上的攝取量明顯減少。3.黃芩苷固體脂質(zhì)納米粒在Caco-2細(xì)胞模型中的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制與BA組相比,BA SLN組在Caco-2細(xì)胞單層由AP到BL的Papp顯著增加,ER顯著下降;BA組和BA SLN組的細(xì)胞間緊密連接蛋白ZO-1呈現(xiàn)連續(xù)狀,且與空白組相比,BA組和BA SLN組的ZO-1蛋白的表達(dá)無顯著差異;MRP2蛋白抑制劑MK-571和BCRP蛋白抑制劑KO-143可降低BA的外排率,而BA SLN則不受外排蛋白抑制劑的影響;與空白組相比,BA對外排蛋白MRP2和BCRP的表達(dá)無顯著影響,BA SLN則顯著降低外排蛋白MRP2和BCRP蛋白的表達(dá)。結(jié)論:1、Caco-2細(xì)胞攝取和轉(zhuǎn)運(yùn)模型建立成功;BA及BA SLN作用于細(xì)胞的安全濃度范圍為0-150μg/mL。2、BA在Caco-2細(xì)胞上的攝取方式為被動擴(kuò)散和主動轉(zhuǎn)運(yùn);BA SLN在Caco-2細(xì)胞上的攝取存在著被動擴(kuò)散和主動轉(zhuǎn)運(yùn),且受內(nèi)吞抑制劑影響,BA SLN可通過內(nèi)吞的方式入胞,從而增加BA攝取量。3、BA SLN顯著增加了BA的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)能力,BA SLN無法打開細(xì)胞間的緊密連接,其增加藥物跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的能力與細(xì)胞旁路途徑無關(guān)。BA易受到外排蛋白MRP2和BCRP的作用被細(xì)胞外排導(dǎo)致吸收較差,將BA載入SLN后,BA SLN可避開了此類外排蛋白的外排作用,從而減少藥物的外排。
【圖文】：

細(xì)胞長到第 5-7 d 時(shí)，進(jìn)行細(xì)胞傳代。將培養(yǎng)兩次，用 1 mL 胰蛋白酶消化，待細(xì)胞脫落收集細(xì)胞，用新鮮的培養(yǎng)液吹散，分為 5 瓶細(xì)胞消化收集好后，加 1.8 mL 血清和 0.2 m封蓋。4 °C 冰箱放置 30 min，20 °C 冰箱放將凍存管放入液氮罐中保存。觀察：在熒光倒置顯微鏡下觀察，剛消化傳代的全部貼壁，第 3 天時(shí)，細(xì)胞數(shù)量明顯增加， 7 天時(shí)，細(xì)胞基本達(dá)到融合，均勻、致密，

每天換液，培養(yǎng)至 14 天，細(xì)胞形態(tài)融合，均勻、致密，邊，先棄去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入 37 °C 的 PBS 溶液 2 mL，孵育 20然后用 PBS 輕輕蕩洗一次。處理后的 Caco-2 細(xì)胞，可用于后續(xù)攝co-2 細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)單層模型的建立與表征細(xì)胞按 1×105個(gè)/mL 接種到 Transwell 小室內(nèi)，如圖 2 所示，，頂端側(cè)5 mL 細(xì)胞混懸液，基底側(cè)（BL）加入 1.5 mL 完全培養(yǎng)液。接種天換液一次，一周后每天換液，培養(yǎng)至 21 d。于實(shí)驗(yàn)室的培養(yǎng)條件不同，造成形成的 Caco-2 細(xì)胞單分子層具有了保證培養(yǎng)的 Caco-2 細(xì)胞能夠很好的模擬小腸上皮細(xì)胞的吸收 Caco-2 細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的檢測是有必要的。本研究用跨膜電阻值磷酸酶（APL）的活性兩個(gè)指標(biāo)進(jìn)行檢驗(yàn)，判斷 Caco-2 細(xì)胞模型5]。
【學(xué)位授予單位】：安徽中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R285

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本文編號：2593847